miR-548t-3p靶向CITED2调控甲状腺癌细胞的凋亡研究

目的探讨miR-548t-3p调控甲状腺癌细胞凋亡的潜在机制。方法选取甲状腺癌患者62例,检测其癌组织和癌旁组织中miR-548t-3p的表达水平。过表达或敲低miR-548t-3p后,检测甲状腺癌细胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平。通过miRDB在线分析和荧光素酶报告实验鉴定miR-548t-3p的底物。结果miR-548t-3p在甲状腺癌组织的表达水平显著高于甲状腺癌旁组织(P<0.05)。过表达miR-548t-3p后,甲状腺癌细胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平均下降(P<0.05);而敲低miR-548t-3p后,甲状腺癌细胞的凋亡水平均上升(P<0.05)。过表达miR-548t-3p后,miR-548t-3p能够显著降低SNRK、VASP、CITED2的mRNA水平(P<0.05)。敲低SNRK、VASP、CITED2后,仅当敲低CITED2时,甲状腺癌细胞SW579的凋亡水平显著下降(P<0.05)。过表达CITED2后,甲状腺癌细胞SW579的凋亡水平显著上升(P<0.05)。敲低miR-548t-3p后,CITED2的蛋白表达水平显著上升。过表达miR-548t-3p后,CITED2的蛋白表达水平显著下降。此外,miR-548t-3p靶向CITED2的3端非编码区(P<0.05)。同时敲低miR-548t-3p和CITED2,SW579细胞的凋亡水平无显著改变(P>0.05);同时过表达miR-548t-3p和CITED2,SW579细胞的凋亡水平无显著改变(P>0.05)。结论miR-548t-3p通过靶向CITED2 mRNA的3端非编码区,降解了CITED2 mRNA并减少了CITED2的蛋白表达,最终抑制了甲状腺癌细胞的凋亡。

miR-548a-3p通过调节NLRP3炎性小体在脓毒症致ARDS中的机制研究

目的 探究微小RNA(miR)-548a-3p通过调节NLRP3炎性小体在脂多糖诱导脓毒症致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的机制。方法 选取45只小鼠按随机数表法分为对照组、ARDS组和ARDS+miR-548a-3p agomir组,每组各15只,通过鼻腔内滴入6 mg/kg的脂多糖至肺构建ARDS模型。为提高miR-548a-3p的水平,腹腔内注射miR-548a-3p agomir(300μg),检测各组的HE染色情况、肺组织损伤评分、白细胞介素(IL)-1β、IL-18、NLRP3蛋白水平。通过双荧光素酶报告验证miR-548a-3p和NLRP3的靶向关系。通过转染miR-548a-3p mimic过表达miR-548a-3p,通过RT-qPCR和Western blot检测各组NLRP3 mRNA和蛋白水平以及IL-1β和IL-18水平。结果 ARDS组的肺组织损伤评分、IL-1β、IL-18和NLRP3蛋白表达水平均显著高于对照组和ARDS+miR-548a-3p agomir组,差异有统计学意义(P <0.05)。双荧光素酶报告实验证实NLRP3是miR-548a-3p的靶基因,miR-548a-3p mimic组细胞的NLRP3 mRNA和蛋白、IL-1β/pro-IL-1β和IL-18的表达水平低于miR-548a-3p NC组,差异有统计学意义(P <0.05)。结论 miR-548a-3p可通过靶向抑制NLRP3蛋白抑制NLRP3炎性小体的激活,从而缓解ARDS炎性损伤。

hsa_circ_0000069通过靶向miR-548c-3p调控胃癌细胞增殖、细胞周期和凋亡

目的 研究hsa_circ_0000069靶向miR-548c-3p在胃癌进展中的功能。方法 RT-qPCR检测胃癌组织、癌旁组织、胃癌细胞(SNU-1、AGS、HS-746T)、人正常胃黏膜上皮细胞GES1中hsa_circ_0000069、miR-548c-3p表达情况。将SNU-1细胞分为对照(NC)组、si-NC组、si-hsa_circ_0000069组、miR-NC组、miR-548c-3p组、pcDNA组、pcDNA-hsa_circ_0000069组、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC组、si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p组。流式细胞术检测细胞凋亡和周期分布;CCK-8法分析细胞活力。hsa_circ_0000069和miR-548c-3p的靶向关系通过双荧光素酶报告实验来验证。结果 胃癌组织中hsa_circ_0000069表达水平显著高于癌旁组织,miR-548c-3p表达水平显著低于癌旁组织(均P<0.05)。SNU-1、AGS、HS-746T细胞中hsa_circ_0000069表达水平显著高于GES1细胞,miR-548c-3p表达水平显著低于GES1细胞(均P<0.05)。与NC组比较,si-hsa_circ_0000069组SNU-1细胞miR-548c-3p表达水平、凋亡率、G0/G1期比例显著升高,细胞活力、S期比例显著降低(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-548c-3p组SNU-1细胞凋亡率、G0/G1期比例显著升高,细胞活力、S期比例显著降低(P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-hsa_circ_0000069组SNU-1细胞miR-548c-3p表达水平显著降低(均P<0.05)。与si-hsa_circ_0000069+anti-miR-NC组比较,si-hsa_circ_0000069+anti-miR-548c-3p组SNU-1细胞凋亡率、G0/G1期比例显著降低,细胞活力、S期比例显著升高(均P<0.05)。结论 干扰hsa_circ_0000069通过靶向miR-548c-3p诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖和周期进展。

miR-548c-3p通过调控TRIM59表达对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的研究miR-548c-3p对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响和潜在的分子机制。方法 qRT-PCR检测TRIM59 mRNA和miR-548c-3p的表达,Western blot检测TRIM59、增殖相关蛋白CyclinD1和p21,及迁移侵袭相关蛋白MMP2和MMP9的表达水平,MTT法测定HepG2细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-548c-3p与TRIM59的调控关系。结果与正常肝细胞L02相比,在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7402组中TRIM59的mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.05),miR-548c-3p的表达量则均显著降低(P<0.05);过表达miR-548c-3p和抑制TRIM59表达均可抑制HepG2细胞增殖、迁移和侵袭;双荧光素酶报告系统结果表明,miR-548c-3p靶向负调控TRIM59的表达;过表达TRIM59逆转了过表达miR-548c-3p对HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-548c-3p通过靶向TRIM59基因抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-548c-3p是肝癌的潜在治疗靶点。

lncRNA TSIX通过靶向miR-548-a-3p抑制肝细胞癌细胞增殖和侵袭的机制研究

目的 探讨lncRNA TSIX通过靶向miR-548-a-3p抑制肝细胞癌(HCC)细胞增殖和侵袭的机制。方法 设肝癌Huh7细胞组、lncRNA TSIX mimics组、lncRNA TSIX inhibitor组;各组细胞培养48 h后,采用MTT法测定细胞活力,结晶紫染色测定单克隆形成数目,流式细胞仪测定细胞凋亡水平,transwell腔室测定细胞侵袭水平,RT-PCR法测定细胞lncRNA TSIX、miR-548-a-3p水平。结果 lncRNA TSIX mimics组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数低于Huh7细胞组(t=8.725、5.437、120.834、64.321,P<0.05),lncRNA TSIX inhibitor组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数高于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组(t=4.124、3.784、10.462、7.965、37.192、174.632、30.703、104.562,P<0.05)。lncRNA TSIX mimics组细胞凋亡率、lncRNA TSIX高于Huh7细胞组[(18.52±2.45)vs(15.63±2.13),(4.47±0.22)vs(2.89±0.21)](t=10.531、12.372,P<0.05),lncRNA TSIX inhibitor组细胞凋亡率、lncRNA TSIX低于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组[(8.14±2.45)vs(15.63±2.13)、(18.52±2.45),(1.58±0.25)vs(2.89±0.21)、(4.47±0.22)](t=37.385、48.021、30.703、104.562,P<0.05)。lncRNA TSIX mimics组miR-548-a-3p低于Huh7细胞组[(2.39±0.19)vs(4.87±0.20)](t=11.265,P<0.05),lncRNA TSIX inhibitor组miR-548-a-3p高于Huh7细胞组和lncRNA TSIX mimics组[(6.32±0.19)vs(4.87±0.20)、(2.39±0.19)](t=6.612、10.058,P<0.05)。结论 lncRNA TSIX明显抑制HCC细胞增殖、侵袭,促进HCC细胞凋亡;其机制可能与lncRNA TSIX负调节miR-548-a-3p有关。

MiR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p及Lin28在肺癌中表达及其意义

探讨miR-199b-3p、miR-373、miR-548c-3p与Lin28在肺癌中的表达,以及它们与临床指标的相关关系.用溶液法提取46例肺癌患者的癌组织和癌旁组织中的总RNA,Q-PCR检测基因的相对表达量.经过两独立样本t检验,比较miR-373(t=3.28,P=0.0007)、lin28(t=3.94,P=0.0016)及miR-548c-3p(t=2.98,P=0.002)在肺癌组织和癌旁组织中的表达,基因表达均有显著性差异.使用Spearman肺癌组织中RNA与免疫组织化学指标发现MiR-b199b-3p与MRP(Rs=0.40,P=0.029),miR-548c-3p和Ki167呈正相关关系(Rs=0.52,P=0.0056),miR-373与K167呈正相关关系(Rs=0.43,P=0.029),Lin28与P53呈负相关关系(Rs=-0.43,P=0.022),还与PGP呈负相关关系(Rs=-0.38,P=0.034).miR-373在肺癌患者组织中基因表达显著下调,而miR-548c-3p与Lin28基因表达呈上调,3个基因的表达与肿瘤的发生发展关系密切.

circ_0005230通过靶向miR-548c-3p影响胆管癌细胞增殖和凋亡的机制

目的:探讨环状RNA(circRNA)circ_0005230对miR-548c-3p的靶向调控和对胆管癌细胞增殖和凋亡的作用与机制。方法:实时定量PCR(qPCR)检测胆管癌组织中circ_0005230和miR-548c-3p表达。将人胆管癌细胞RBE分为si-NC组、si-circ_0005230组、pcDNA-NC组、pcDNA-circ_0005230组、miR-NC组、miR-548c-3p组、si-circ_0005230+anti-miR-NC组、si-circ_0005230+anti-miR-548c-3p组,分别通过Lipofectamine 2000转染si-NC、si-circ_0005230、pcDNA-NC、pcDNA-circ_0005230、miR-NC、miR-548c-3p mimic、si-circ_0005230和anti-miR-NC、si-circ_0005230和miR-548c-3p inhibitor。以CCK-8法、克隆形成实验、免疫印迹实验(Western blot)和流式细胞术分别进行细胞的增殖、克隆形成、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)表达及细胞凋亡测定。双荧光素酶报告实验分析circ_0005230与miR-548c-3p靶向关系。结果:30例胆管癌组织中circ_0005230表达量高于癌旁组织,miR-548c-3p表达量低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。si-circ_0005230组或miR-548c-3p组RBE细胞的活性、克隆形成数、增殖蛋白CyclinD1和p21表达量减少,凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达量和凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。circ_0005230靶向调控miR-548c-3p的表达。pcDNA-circ_0005230组比pcDNA-NC组降低miR-548c-3p表达量,si-circ_0005230组较si-NC组提高miR-548c-3p表达量,差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-circ_0005230+anti-miR-NC组比较,si-circ_0005230+anti-miR-548c-3p组RBE细胞的活性、克隆形成数、增殖蛋白CyclinD1和p21表达量升高,凋亡蛋白Caspase-3、Bax表达量和凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:circ_0005230在胆管癌组织中高表达,抑制circ_0005230表达通过靶向miR-548c-3p减弱胆管癌细胞的增殖和诱导其凋亡。

miR-4727-5p通过调控EPS8L3表达抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移

目的 探讨微小RNA-4727-5p(miR-4727-5p)靶向表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白3(epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 3,EPS8L3)抑制乳腺癌细胞增殖和迁移的分子作用机制。方法 选取2019年2月至2021年9月在南通大学附属肿瘤医院(南通市肿瘤医院)乳腺外科手术切除的38例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织,以及乳腺癌细胞系MB-MDA-468、SKBR3、MCF-7、T-47D及正常乳腺上皮细胞MCF-10A,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测乳腺癌组织和细胞系中miR-4727-5p的表达。将重组质粒miR-4727-5p或空载质粒转染至T-47D细胞,分别命名为miR-4727-5p组和对照组(Ctrl组)。用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和划痕愈合试验分别分析T-47D细胞的增殖和迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证miR-4727-5p与EPS8L3 mRNA非翻译区的靶向关系。qRT-PCR和Western blot检测EPS8L3基因和EGFR信号通路蛋白p-EGFR、p-Raf1、p-MEK1的表达。结果 与癌旁组织比较,乳腺癌组织miR-4727-5p表达显著降低(P<0.01)。与MCF-10A细胞比较,乳腺癌细胞系中miR-4727-5p表达显著降低(P<0.05)。与Ctrl组比较,miR-4727-5p组T-47D细胞增殖能力明显降低(P<0.05),细胞侵袭能力明显降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,EPS8L3是miR-4727-5p的靶基因。与Ctrl组比较,miR-4727-5p组EPS8L3基因表达水平明显降低(P<0.01),p-EGFR、p-Raf1、p-MEK1蛋白表达水平明显降低。结论 miR-4727-5p通过靶向抑制EPS8L3基因表达,干扰EGFR信号通路转导,从而抑制乳腺癌T-47D细胞的增殖和迁移能力。

miR-548b-3p通过调控诱骗受体3的表达影响肝癌细胞恶性生物学性状的研究

目的探讨miR-548b-3p是否可以通过下调诱骗受体3(DcR3)的表达进而调节肝癌细胞的恶性生物学性状。方法通过实时荧光定量PCR检测Hep3b、HepG2、Huh7.5.1、PLC、97H等5种常见肝癌细胞系中miR-548b-3p的水平,实验用肝癌细胞系购自上海市肿瘤研究所。裸鼠皮下成瘤性实验包括miR-548b-3p过表达和低表达两部分:miR-548b-3p过表达实验包括Huh7.5.1-miR-548b-3p细胞组和Huh7.5.1-NC细胞组;miR-548b-3p低表达实验组包括PLC-miR-548b-3p-sponge组和PLC-NC细胞组,每组分别5只裸鼠。实验用裸鼠为雄性Balb/c品系,体重20~25 g,4~6周龄。利用Starbase软件预测miR-548b-3p与DcR3是否存在结合位点;双荧光素酶报告实验验证DcR3是否为miR-548b-3p的靶基因。通过拯救实验验证miR-548b-3p对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响是否通过DcR3来实现。采用Graphpad Prism 9进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x^(-)±s)表示,组间比较采用t检验。结果实时荧光定量PCR以2-ΔΔCt相对表达量为参数进行比较,假设Hep3b相对表达量为1,HepG2相对表达量为0.902,Huh7.5.1相对表达量为0.712,PLC相对表达量为1.293,97H相对表达量为0.818,最后结果表明,miR-548b-3p表达最高的是PLC细胞,表达最低的是Huh7.5.1细胞;裸鼠皮下成瘤性实验表明,实验4周后,Huh7.5.1-miR-548b-3p组成瘤体积为(444.77±142.34)mm^(3),Huh7.5.1-NC组成瘤体积为(918.80±139.21)mm^(3);PLC-miR-548b-3p-sponge组成瘤体积为(407.49±58.50)mm^(3),PLC-NC组成瘤体积为(218.62±47.55)mm^(3);利用Starbase软件预测到miR-548b-3p与DcR3存在结合位点;双荧光素酶报告实验证明DcR3是miR-548b-3p的靶基因;拯救实验验证miR-548b-3p对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响是通过DcR3来实现的。结论miR-548b-3p可调节肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学性状,并且是通过下调DcR3的表达水平来实现的。

lncRNA LINC00909靶向miR-548-3p对结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的探讨lncRNA LINC00909是否通过靶向miR-548-3p而影响结直肠癌细胞放射敏感性。方法采用qRT-PCR检测结直肠癌组织、癌旁组织中LINC00909、miR-584-3p的表达量;体外培养结直肠癌细胞SW480、SW620,分别将si-NC、si-LINC00909、miR-NC、miR-584-3p mimics、si-LINC00909与anti-miR-NC、si-LINC00909与anti-miR-584-3p转染至SW480、SW620细胞,用4 Gy照射细胞;克隆形成实验检测细胞存活分数及放射增敏比;MTT检测细胞增殖;Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验验证LINC00909、miR-584-3p的靶向关系。裸鼠皮下移植瘤实验检测干扰LINC00909表达或抑制miR-584-3p表达对照射后移植瘤重量的影响。结果结直肠癌组织中LINC00909的表达水平显著升高(P<0.05),miR-584-3p的表达水平显著降低(P<0.05);干扰LINC00909表达或miR-584-3p过表达后细胞存活分数明显降低(P<0.05),放射增敏比分别为2.017、1.762,并可抑制增殖、迁移及侵袭(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实LINC00909可靶向结合miR-584-3p;干扰LINC00909表达后移植瘤重量显著降低(P<0.05)。共转染anti-miR-584-3p后移植瘤重量显著升高(P<0.05)。结论干扰LINC00909表达可通过上调miR-548-3p的表达而减弱结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力从而增强细胞放射敏感性。

HIF1A-AS2靶向miR-548c-3p对肝癌HepG2生长、运动的调节作用

目的 研究敲除HIF1A-AS2靶向miR-548c-3p对肝癌HepG2生长、运动的调节作用.方法 RT-PCR与荧光素酶实验验证HIF1A-AS2与miR-548c-3p的靶向关系;sh-HIF1A-AS2和miR-548c inhibitor转染HepG2细胞, EDU染色检测细胞增殖;Transwell检测细胞侵袭;构建HepG2裸鼠移植瘤模型, 检测肿瘤重量, 通过western印迹和免疫组化检测分析组织和细胞中VEGF、 Vimentin、 N-cadherin、 E-cadherin及Ki67、PCNA的表达.结果 sh-HIF1A-AS2能够靶向促进miR-548c-3p的表达 ( P<0.05);sh-HIF1A-AS2能显著抑制HepG2细胞增殖、侵袭 (P<0.05), 抑制肿瘤生长 (P<0.05), 下调细胞和组织中VEGF、 Vimentin、N-cadherin、 Ki67及PCNA表达量, 增加E-cadherin的蛋白水平 ( P<0.05), miR-548c inhibitor能减弱sh-HIF1A-AS2对HepG2细胞增殖、侵袭 (P<0.05).结论 敲除HIF1A-AS2可以靶向上调miR-548c-3p的表达, 抑制HepG2细胞的增殖和侵袭.