华蟾酥毒基通过调控circNFIX/miR-577通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:研究华蟾酥毒基(CnBu)对乳腺癌细胞MDA-MB-231恶性生物学行为的影响,并探讨其机制是否与调控环状RNA核因子IX(circNFIX)和miR-577表达相关。方法:将MDA-MB-231细胞分为对照(Con)组、CnBu-低剂量(L)组、CnBu-中剂量(M)组、CnBu-高剂量(H)组、si-NC组、si-circNFIX组、pcDNA组、pcDNA-circNFIX组、CnBu+pcDNA组、CnBu+pcDNAcircNFIX组。MTT、Transwell实验分析细胞增殖、迁移和侵袭能力,Westernblot分析Ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白表达。RT-qPCR分析circNFIX、miR-577表达量。双荧光素酶报告实验和RT-qPCR验证circNFIX和miR-577的靶向调控关系。结果:CnBu以剂量依赖方式下调Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白和circNFIX表达(P<0.05),上调miR-577表达(P<0.05),减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。miR-577与circNFIX序列直接结合,干扰或过表达circNFIX可显著提高或降低miR-577表达水平(P<0.05)。干扰circNFIX表达显著下调Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05),减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05)。过表达circNFIX显著减弱CnBu对MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响(P<0.05)。结论:CnBu可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭,可能通过下调circNFIX/miR-577通路实现。

外泌体介导的miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对细胞增殖、侵袭的影响和潜在分子机制。方法收集2016年6月至2019年12月确诊的30例幼儿喉乳头状瘤组织样本及其相匹配且远离病灶经病理检查证实的正常喉组织样本,并选取人正常喉上皮细胞株和喉乳头状瘤细胞(分为miR-577过表达组、阴性对照组及空白对照组)进行研究。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测30例喉乳头状瘤组织、配对正常喉组织、正常喉上皮细胞和喉乳头状瘤细胞中miR-577相对表达;通过Lipofectamine^(TM)3000脂质体转染试剂盒将miR-577 mimic模拟物转染至喉乳头状瘤细胞构建miR-577过表达细胞系,采用CCK-8法、Tanswell实验分别检测miR-577对喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭的影响;采用Western blot检测miR-577对喉乳头状瘤细胞侵袭相关蛋白(MMP-1、MMP-9)表达及Notch通路相关蛋白(Notch、DSL)表达的影响。结果幼儿喉乳头状瘤组织中miR-577相对表达量(0.134±0.026)显著低于正常喉组织(0.823±0.056)(P<0.001);喉乳头状瘤细胞中miR-577相对表达量(0.256±0.026)显著低于正常喉上皮细胞(0.962±0.072)(P<0.001);与阴性对照组相比,转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞增殖能力(1.248±0.103 vs 0.902±0.094)和细胞侵袭率(71.016±5.869 vs 42.867±4.795)明显降低(P<0.05);侵袭相关蛋白MMP-1(1.011±0.124 vs 0.417±0.056)、MMP-9(1.012±0.155 vs 0.502±0.058)表达抑制(P<0.01)。喉乳头状瘤细胞中Notch、DSL表达显著上调(P<0.05);转染miR-577 mimic后喉乳头状瘤细胞中Notch通路相关蛋白Notch、DSL表达明显抑制(P<0.05)。共转染miR-577 mimic和pcDNA3.1-Notch后喉乳头状瘤细胞增殖能力和细胞侵袭率较单纯转染miR-577 mimic组明显增加(P<0.05);共转染pcDNA3.1-Notch逆转了miR-577 mimic对喉乳头状瘤细胞增殖、侵袭能力的抑制作用。结论幼儿喉乳头状瘤组织及喉乳头状瘤细胞中miR-577显著低表达,过表达miR-577显著抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭;Notch是miR-577的潜在靶点,miR-577可能通过与Notch的3'UTR区结合进而调控Notch信号通路来抑制喉乳头状瘤细胞的增殖和侵袭。

miR-577靶向Ku80调控小细胞肺癌细胞中PD-L1表面表达的机制研究

目的探讨DNA损伤引起小细胞肺癌细胞NCI-H1688中PD-L1表面表达的潜在分子机制。方法使用DNA损伤诱导剂ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,检测细胞中PD-L1的蛋白水平和mRNA水平。通过高通量测序检测ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688前后miRNA表达差异。过表达差异miRNA,检测细胞中PD-L1的mRNA水平。通过miRDB在线分析和荧光素酶报告实验寻找miRNA的靶标。结果ETP、CPT、APH诱导小细胞肺癌细胞NCI-H1688DNA损伤后,PD-L1的表达在mRNA水平和蛋白水平上均上升(P<0.05)。将ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后的高通量测序结果取交集后,共有11种基因的表达受到调控。敲低上述基因后发现,敲低Ku80时,PD-L1的表达上升(P<0.05)。过表达Ku80后,PD-L1的表达下降(P<0.05)。ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,Ku80的mRNA水平下降(P<0.05),但是Ku80的启动子活性没有显著变化(P<0.05)。miRNA mimics过表达miRDB在线分析Ku80的潜在miRNA后,发现10种miRNA能够显著降低Ku80的表达(P<0.05)。ETP、CPT、APH处理小细胞肺癌细胞NCI-H1688后,miR-577的表达水平显著上升(P<0.05)。过表达miR-577后,Ku80的m RNA和蛋白水平均上升(P<0.05);敲低miR-577后,Ku80的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05)。过表达miR-577后,PD-L1的mRNA和蛋白水平均下降(P<0.05);敲低miR-577后,PD-L1的mRNA和蛋白水平均上升(P<0.05)。结论miR-577通过靶向DNA损伤应答蛋白Ku80 mRNA的3端非编码区以影响其翻译水平,最终提高了PD-L1在小细胞肺癌细胞NCI-H1688中的表达水平。

miR-577对脑胶质瘤U251细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨miR-577调节Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt2b对脑胶质瘤U251细胞活力和凋亡的影响。方法:将U251细胞分为miR-对照组(转染miR-577阴性对照)、miR-577组(转染miR-577模拟物)、抑制对照组(转染miR-577抑制物对照)、miR-577抑制组(转染miR-577抑制物)、miR-577+Wnt2b组(转染miR-577模拟物与pcDNA-Wnt2b),采用qRT-PCR法检测转染后细胞miR-577的表达,CCK-8法及流式细胞术分别检测细胞活力和凋亡率。通过双荧光报告基因检测系统验证miR-577和Wnt2b的靶向关系。结果:miR-577组与miR-对照组相比,miR-577的表达水平升高。双荧光报告基因证实Wnt2b是miR-577的靶基因,miR-577组与miR-对照组相比Wnt2b蛋白的表达水平降低,miR-577抑制组与抑制对照组相比Wnt2b蛋白的表达水平升高(P<0.05)。miR-577+Wnt2b组与miR-577组相比,细胞活力升高,凋亡率降低(P<0.05)。结论:miR-577可通过下调Wnt/β-catenin信号通路Wnt2b蛋白表达抑制脑胶质瘤U251细胞活力,诱导细胞凋亡。

lncRNA EGFR-AS1靶向miR-577对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)EGFR-AS1对微小RNA-577(miR-577)的靶向关系及对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:实时荧光定量PCR(q PCR)检测卵巢癌组织中lncRNA EGFR-AS1和miR-577表达。Lnc Base Predicted v.2预测和双荧光素酶报告实验分析lncRNA EGFR-AS1与miR-577的靶向关系。卵巢癌细胞SKOV3中转染si-EGFR-AS1或miR-577,噻唑蓝(MTT)和流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。si-EGFR-AS1和anti-miR-577共转染,观察抑制miR-577表达在干扰lncRNA EGFR-AS1表达诱导的SKOV3细胞增殖和凋亡中的作用。结果:卵巢癌组织中lncRNA EGFR-AS1表达量显著高于癌旁组织,miR-577表达量显著低于癌旁组织(P<0.01)。lncRNA EGFR-AS1与miR-577具有靶向结合位点,转染miR-577的WT-EGFR-AS1细胞荧光素酶相对活性显著低于转染miR-NC组(P<0.01)。干扰lncRNA EGFR-AS1表达明显降低SKOV3细胞24,48,72 h的吸光度(A)值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达量,显著增加细胞凋亡率及p21、Bax蛋白水平(P<0.05或P<0.01)。miR-577过表达显著降低SKOV3细胞48和72 h的A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平,显著提高细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达量(P<0.05)。与si-EGFR-AS1和anti-miR-NC共转染比较,si-EGFR-AS1和anti-miR-577共转染显著减少SKOV3的细胞凋亡率及p21、Bax蛋白表达量,显著提高24,48,72 h的A值及Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平(P<0.05)。结论:lncRNA EGFR-AS1在卵巢癌中表达上调,干扰lncRNA EGFR-AS1表达可抑制卵巢癌细胞增殖,并诱导凋亡,其作用机制与靶向调控miR-577表达有关。

miR-577通过介导Notch信号通路抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和耐药性

目的研究miR-577通过介导Notch信号通路抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和耐药性。方法RT-PCR检测肺癌组织和细胞以及配对的正常组织和细胞中miR-577的表达量;CCK-8测定miR-577对肺癌细胞A549增殖的影响;荧光素酶报告实验验证miR-577和Notch是否结合;Western blot检测A549细胞中Notch、DSL以及耐药蛋白P-gp和MRP1的蛋白表达水平。结果RT-PCR结果显示,miR-577在肺癌组织和细胞中的表达量显著低于正常组织和细胞中的表达量;过表达miR-577能够显著抑制肺癌细胞A549的增殖和侵袭,并降低细胞的耐药性;荧光素酶报告实验结果表明miR-577能够靶向结合Notch的启动子序列;Western blot结果显示miR-577能够抑制Notch和DSL的蛋白表达水平;进一步的机制探究结果表明miR-577可通过下调Notch和DSL的蛋白表达抑制A549细胞增殖、侵袭以及耐药性。结论miR-577能够抑制肺癌细胞A549增殖、侵袭以及耐药性的产生,其作用机制是通过介导Notch信号通路来实现的。

miR-577通过靶向调控HOXA1对乳腺癌MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:探讨miR-577靶向调控HOXA1对乳腺癌MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:将体外培养的MDB-MA-231细胞分为对照组(未处理)、miR-NC组(转染miR-577模拟物阴性对照)、miR-577组(转染miR-577模拟物)、miR-577+pcDNA组(转染miR-577模拟物和pcDNA3.1质粒)和miR-577+HOXA1组(转染miR-577模拟物和pcDNA3.1-HOXA1质粒),采用实时荧光定量PCR测定MDB-MA-231细胞中miR-577和HOXA1 mRNA的表达,Western blot测定HOXA1蛋白表达,荧光素酶报告基因实验测定miR-577和HOXA1的靶向关系,CCK-8法测定MDB-MA-231细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期分布,Transwell小室测定MDB-MA-231细胞侵袭和迁移。结果:与对照组、miR-NC组相比,miR-577组细胞中miR-577表达水平、G0/G1期细胞百分比升高,HOXA1 mRNA和蛋白表达水平、48与72 h细胞增殖活力、S期细胞百分比、侵袭细胞数和迁移细胞数均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-577组、miR-577+pcDNA组相比,miR-577+HOXA1组中HOXA1 mRNA和蛋白表达水平、48与72 h细胞增殖活力、S期细胞百分比、侵袭细胞数和迁移细胞数均升高,G0/G1期百分比降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-577可通过靶向HOXA1抑制MDB-MA-231细胞增殖、侵袭和迁移。

双荧光素酶报告基因系统鉴定has-miR-577和has-miR-583对FGF-21基因的靶向调控

目的通过构建成纤维细胞生长因子-21基因(fibroblast growth factor 21,FGF-21)荧光素酶报告基因载体,观察has-miR-577和has-miR-583对FGF-21基因的靶向调控。方法利用生物学信息网站对has-miR-577和has-miR-583靶向结合FGF-21 3′UTR区的位点进行分析,设计合成包含与has-miR-577和has-miR-583结合序列及其突变序列的FGF-21基因片段,构建野生型(psiCHECK2-FGF-21)和突变型(psiCHECK2-FGF-21-mut)FGF-21双荧光素酶报告基因载体。进行双酶切电泳和测序鉴定后,FGF-21野生型与突变型双荧光素酶报告基因载体分别+〔hsa-miR-577模拟物、hsa-miR-583模拟物和miR无义序列阴性对照(miR negative control,miR-NC)〕转染293T细胞,检测荧光素酶活性,观察has-miR-577和has-miR-583对FGF-21表达的影响。结果双酶切电泳和测序结果显示,野生型(psiCHECK2-FGF-21)和突变型(psiCHECK2-FGF-21-mut)基因载体片段大小、序列结果与实验预期一致,载体构建成功。has-miR-577和has-miR-583可抑制野生型FGF-21载体的荧光表达(P<0.05),而对突变型FGF-21载体的荧光表达无抑制作用。结论 has-miR-577和has-miR-583可以靶向调控FGF-21的表达。

lncRNA THAP9-AS1靶向miR-577调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)THAP9反义RNA1(THAP9-AS1)对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法收集苏州市立区院东区2017-2019年手术切除并经病理证实的结直肠癌组织标本30例,所有患者术前未接受过放化疗,另取距离癌组织边缘5 cm处的正常组织作为对照。将si-NC、si-THAP9-AS1、miR-NC、miR-577分别转染至SW620细胞中,分别记为si-NC组、si-THAP9-AS1组、miR-NC组、miR-577组;将siTHAP9-AS1分别与anti-miR-NC、anti-miR-577共转染至SW620细胞中,分别记为si-THAP9-AS1+anti-miR-NC组、siTHAP9-AS1+anti-miR-577组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA THAP9-AS1和miR-577表达水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖活性;Transwell检测细胞迁移和侵袭;蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测lncRNA THAP9-AS1和miR-577的靶向关系。结果与癌旁组织比较,结直肠癌组织中THAP9-AS1表达水平显著升高,miR-577表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制lncRNA THAP9-AS1表达或过表达miR-577,结直肠癌细胞SW620中细胞活性显著降低,细胞迁移、侵袭数显著降低,CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平显著降低,p21表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。lncRNA THAP9-AS1靶向调控miR-577的表达;干扰miR-577表达逆转了抑制lncRNA THAP9-AS1表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论lncRNA THAP9-AS1通过下调miR-577抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577mimic、miR-577inhibitor和miR577-NC。转染24h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P<0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P<0.05)。结论miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。