LncRNANNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1轴激活Hippo-YAP/TAZ信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞干性影响

目的检测膀胱癌中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制。方法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组。采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性。检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1的靶向结合关系。Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值。结果与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P<0.001)。与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472~51.160,均P<0.001)。与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P<0.05);sh-NNT-AS1组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65个vs 354.30±7.84个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33个vs 303.00±9.07个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17个vs 41.35±3.67个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P<0.001)。与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P<0.001)。与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P<0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNANNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-582-5p/NCKAP1轴。与sh-NNT-AS1组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977~11.628,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877~16.323,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个vs 81.42±13.22个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21个vs 92.13±12.65个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个vs 18.98±1.16个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650~21.243,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412~17.889,均P<0.001)。结论膀胱癌中LncRNA NNT-AS1表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成。

miR-582-5p靶向调控FOXO1对新生大鼠缺血缺氧性脑病神经元损伤的影响

目的 探讨微小RNA-582-5p(miR-582-5p)靶向调控叉头框转录因子1(FOXO1)对新生大鼠缺血缺氧性脑病(HIE)神经元损伤的影响。方法 90只新生大鼠按照随机数字表法均分为对照(NC)组、模型(HIE)组、miRNA对照(LV-miRNA-NC)组、miR-582-5p过表达(LV-miR-582-5p)组、miR-582-5p过表达+mRNA对照(LV-miR-582-5p+LV-NC)组、miR-582-5p过表达+FOXO1过表达(LV-miR-582-5p+LV-FOXO1)组。除NC组外的各组大鼠建立HIE模型,对大鼠进行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,Real-time PCR检测miR-582-5p和FOXO1表达,双萤光素酶报告基因实验检测miR-582-5p和FOXO1靶向关系,HE染色观察海马组织病理变化,TUNEL和Neu N荧光双标共定位检测海马组织神经元凋亡,免疫组化染色检测FOXO1、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达。结果miR-582-5p和FOXO1具有靶向关系,与NC组比较,HIE组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达增加,miR-582-5p表达降低,海马组织出现病理损伤(P<0.05);与LVmiRNA-NC组比较,LV-miR-582-5p组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达降低,miR-582-5p表达增加,海马组织病理损伤好转(P<0.05);LV-FOXO1可以逆转LV-miR-582-5p对于HIE大鼠神经元损伤的保护作用。结论 miR-582-5p可以直接靶向负调控FOXO1表达,减少HIE新生大鼠神经元凋亡,对神经损伤具有保护作用。

大黄素通过调节miR-582-3p影响MAP3K1活性抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡

目的 探讨大黄素(emodin,EMO)通过microRNA(miR)-582-3p/MAP3K1对乳腺癌细胞增殖、凋亡的作用及分子机制。方法 培养人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺细胞系Hs578Bst,使用不同浓度的EMO处理细胞,细胞根据培养条件分为对照组、EMO(10μM)组、NC mimics组、NC mimics+EMO组、miR-582-3p mimics组和miR-582-3p mimics+EMO组,检测EMO及miR-582-3p异常表达对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。荧光定量(qRT-PCR)检测miR-582-3p及MAP3K1的表达。MTT和EdU实验检测乳腺癌细胞增殖,流式细胞术和TUNEL实验检测细胞凋亡及细胞周期。蛋白印迹(Western blot)检测增殖标志蛋白Ki-67及凋亡标志蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3在癌细胞中的表达水平。结果 EMO可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7的增殖能力[(17.65±0.96)%比(28.63±2.16)%,(15.02±1.71)%比(28.22±1.89)%,P<0.05]、调节细胞周期并促进细胞凋亡[(23.67±1.25)%比(5.73±0.84)%,(27.33±1.73)%比(5.17±0.85)%,P<0.05]。Western blot结果显示,EMO可抑制细胞中Ki-67及Bcl-2的表达并促进Caspase-3(cleaved)及Bax的表达(P<0.05)。EMO处理乳腺癌细胞后miR-582-3p的表达显著下调[(0.45±0.09)比(1.00±0.10),(0.37±0.05)比(1.00±0.11),P<0.01],而过表达miR-582-3p会逆转EMO对乳腺癌细胞生物学活性的影响(P<0.05)。EMO还会通过miR-583-3p调节癌细胞中MAP3K1的表达(P<0.05)。结论 EMO可能通过调节miR-582-3p影响MAP3K1活性抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡。

circLRP6调节miR-31-5p/HMGA1轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的分析circLRP6调节miR-31-5p/高迁移率族蛋白A1(HMGA1)轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组,对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内,实时定量PCR测定细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1 mRNA水平,试剂盒测定细胞上清液白细胞介素-6(IL-6)水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙二醛(MDA)含量;流式细胞仪观察细胞凋亡;Western blotting测定细胞HMGA1、Bax、Bcl-2蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验分析miR-31-5p与circLRP6、HMGA1的靶向关系。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞circLRP6水平升高,细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+si-circLRP6组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。miR-31-5p与circLRP6、HMGA1均具有靶向关系。结论沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p,抑制HMGA1表达,对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

miR-340-5p靶向调控ARID1A对甲状腺癌活性、迁移和侵袭的影响

目的 探讨miR-340-5p靶向调控富含AT的相互作用结构域(ARID)1A对甲状腺癌活性、迁移和侵袭的影响。方法 通过实时荧光定-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western印迹检测miR-340-5p和ARID1A在甲状腺癌细胞中表达水平。通过噻唑蓝(MTT)和Transwell实验检测转染miR-340-5p抑制物后癌细胞活性、迁移和侵袭变化。双荧光素酶报告基因检测miR-340-5p和ARID1A的靶向结合关系。最后通过同时敲低miR-340-5p和ARID1A的回复实验验证miR-340-5p调控ARID1A影响癌症发展。结果 miR-340-5p在甲状腺癌细胞中明显高表达,ARID1A表达明显较低(P<0.05)。通过抑制BCPAP细胞中miR-340-5p表达明显减少了癌细胞活性、迁移和侵袭水平。miR-340-5p和ARID1A具有直接靶向结合关系。敲降ARID1A能够明显逆转miR-340-5p抑制物对BCPAP细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-340-5p是甲状腺癌中的促癌基因,ARID1A为miR-340-5p的靶标下游,miR-340-5p通过靶向调控ARID1A促进甲状腺癌细胞活性、迁移和侵袭。

LncRNA DGUOK-AS1调控miR-204-5p对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)脱氧鸟苷激酶反义RNA(DGUOK-AS)1调控miR-204-5p对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析肝癌组织中DGUOK-AS1和miR-204-5p表达量。双荧光素酶报告实验确定DGUOK-AS1与miR-204-5p靶向关系,RT-qPCR检测干扰DGUOK-AS1表达后MHCC97-H细胞miR-204-5p表达量。集落形成实验分析DGUOK-AS1和miR-204-5p表达对MHCC97-H细胞增殖的影响。流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡。Transwell实验分析细胞迁移和侵袭。结果 与癌旁组织比较,肝癌组织中DGUOK-AS1表达量明显上调,而miR-204-5p表达量明显下调(P<0.05)。miR-204-5p是DGUOK-AS1的靶基因。干扰DGUOK-AS1表达后miR-204-5p表达量显著升高(P<0.05)。干扰DGUOK-AS1表达后MHCC97-H细胞克隆形成数、迁移和侵袭细胞数、S期细胞比例显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与干扰DGUOK-AS1表达比较,同时干扰DGUOK-AS1和miR-204-5p表达后MHCC97-H细胞克隆形成数、迁移和侵袭细胞数、S期细胞比例显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论 干扰DGUOK-AS1通过靶向miR-204-5p可抑制肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。

lncRNA TUG1靶向调节miR-31-5p对急性胰腺炎小鼠炎症反应的影响

目的:探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)在急性胰腺炎(AP)中的作用机制。方法:体外培养小鼠胰腺腺泡细胞系(MPC-83),用脂多糖(LPS,10μg/ml)和雨蛙素(Caerulein,100 nmol/L)处理3 h,建立AP模型。实验分为对照组(control组)、AP组、AP+sh-NC组、AP+sh-TUG1组、AP+sh-TUG1+inhibitor-NC组、AP+sh-TUG1+miR-31-5p inhibitor组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA TUG1和miR-31-5p之间的靶向关系。构建AP小鼠模型,给予相应的干预后,qRT-PCR检测胰腺组织中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;试剂盒检测血清中炎症因子IL-1β、TNF-α含量和淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)活性;HE染色观察胰腺组织病理学变化;TUNEL检测胰腺组织中细胞凋亡。结果:在Caerulein和LPS共同处理的MPC-83细胞中lncRNA TUG1水平、细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平升高,miR-31-5p水平、细胞活力降低(均P<0.05);敲低lncRNA TUG1可上调miR-31-5p,增加细胞活力,降低IL-1β和TNF-α水平,抑制细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-31-5p表达可减弱敲低lncRNA TUG1对细胞炎症反应的抑制作用。miR-31-5p是lncRNA TUG1的直接靶标。在体内敲低lncRNA TUG1表达可上调AP小鼠胰腺组织中miR-31-5p表达,降低IL-1β、TNF-α水平,减少细胞凋亡,改善胰腺组织损伤。结论:敲低lncRNA TUG1可能通过上调miR-31-5p表达水平,抑制炎症反应,改善AP。

沉默lncRNA MCF2L-AS1通过miR-138-5p/AnxA2轴抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:探究lncRNA MCF2L-AS1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响与机制。方法:qRT-PCR检测正常人乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系(MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231)中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p水平;将si-NC、si-MCF2L-AS1、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor分别转染至MDA-MB-415细胞并命名为si-NC组、si-MCF2L-AS1组、si-MCF2L-AS1+inhibitor NC组、si-MCF2L-AS1+miR-138-5p inhibitor组,未做任何处理的MDA-MB-415细胞记为NC组。qRT-PCR检测MDA-MB-415细胞中lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p表达;MTT法检测MDA-MB-415细胞增殖情况;流式细胞术检测MDA-MB-415细胞凋亡率;Transwell检测MDA-MB-415细胞侵袭、迁移数量;Western blot检测MDA-MB-415细胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、AnxA2蛋白水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、AnxA2的关系;小鼠异种移植实验检测肿瘤生长。结果:与MCF-10A细胞相比,MDA-MB-415、MCF7、SKBR3、MDA-MB-231细胞中lncRNA MCF2L-AS1、AnxA2水平显著上调(P<0.05),miR-138-5p表达显著下调(P<0.05)。与NC组、si-NC组相比,si-MCF2L-AS1组MDA-MB-415细胞OD 560 nm值、迁移、侵袭细胞数量、lncRNA MCF2L-AS1表达、N-cadherin、Vimentin蛋白水平、小鼠肿瘤体积、肿瘤质量显著下降(P<0.05),MDA-MB-415细胞凋亡率、miR-138-5p表达、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);而抑制miR-138-5p表达减弱了沉默lncRNA MCF2L-AS1抑制MDA-MB-415细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长的效果;lncRNA MCF2L-AS1负向调控miR-138-5p/AnxA2轴。结论:沉默lncRNA MCF2L-AS1可能通过上调miR-138-5p来下调AnxA2的表达,进而抑制乳腺癌MDA-MB-415细胞增殖、迁移和侵袭。

miR-185-5p通过靶向抑制IL-1β减轻急性痛风性关节炎的炎症反应

目的 探索白细胞介素1β(IL-1β)在急性痛风性关节炎(AGA)的关节损伤过程中与miR-185-5p的关系。方法 采用实时荧光定量PCR检测89名AGA患者及91名健康志愿者的血清miR-185-5p的水平,采用Pearson相关系数法评估miR-185-5p的表达水平与视觉模拟(VAS)评分以及IL-1β水平之间的相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估miR-185-5p对AGA的诊断价值。采用尿酸钠(MSU)诱导THP-1细胞建立体外急性痛风性炎症细胞模型,通过体外转染miR-185-5p模拟物或抑制物增加或降低THP-1细胞miR-185-5p的表达水平后,采用ELISA检测THP-1细胞白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-8及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平;荧光素酶报告基因实验确定miR-185-5p与IL-1β的3′-非翻译区(3′-UTR)的相互作用。结果 与健康对照组相比,AGA患者血清miR-185-5p的水平显著降低;血清miR-185-5p的水平与VAS评分和IL-1β的表达水平均呈负相关;ROC曲线下面积为0.905,敏感性为80.17%,特异性为83.52%。下调miR-185-5p显著促进THP-1细胞IL-1β、 IL-8及TNF-α的表达,而过表达miR-185-5p则呈现相反的结果;荧光素酶报告基因实验显示IL-1β是miR-185-5p的靶基因,并且负调控IL-1β的表达。结论 miR-185-5p通过靶向抑制IL-1β减轻AGA的炎症反应。

lncRNA SNHG7通过miR-122-5p/CCND1轴调节胃癌细胞的增殖、凋亡及肿瘤免疫逃逸

目的探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因(lncRNA SNHG)7通过miR-122-5p/细胞周期蛋白(CCN)D1轴对胃癌细胞的增殖、凋亡及肿瘤免疫逃逸的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测体外培养的人胃癌细胞株NCI-N87、SNU-1、MKN-45和人胃癌组织源细胞、人胃黏膜上皮细胞中lncRNA SNHG7、miR-122-5p与CCND1表达。体外培养的人胃癌细胞MKN-45,随机分为对照组、lncRNA SNHG7 siRNA(si-lncRNA SNHG7)组、lncRNA SNHG7 siRNA阴性对照(si-NC)组、lncRNA SNHG7 siRNA(si-lncRNA SNHG7)+miR-122-5p inhibitor组,分组转染后,检测各组MKN-45细胞增殖、凋亡、活化CD8+T细胞杀伤率、miR-122-5p及CCND1、细胞增殖核抗原(PCNA)、凋亡蛋白〔B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3〕表达,并检测lncRNA SNHG7对MKN-45细胞miR-122-5p的靶向调节作用。结果与胃黏膜上皮细胞相比,胃癌组织源和MKN-45、SNU-1、NCI-N87细胞lncRNA SNHG7、CCND1 mRNA表达明显升高,miR-122-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组相比,si-lncRNA SNHG7组细胞活力、EdU阳性率、细胞CCND1、PCNA蛋白表达明显降低,凋亡率、活化CD8+T细胞对各组MKN-45细胞的杀伤率、miR-122-5p及Bax、caspase-3蛋白表达明显升高(均P<0.05);si-NC组细胞各指标均无显著差异(P>0.05);lncRNA SNHG7 siRNA和miR-122-5p inhibitor联合可逆转lncRNA SNHG7 siRNA对细胞各指标的作用。lncRNA SNHG7可靶向下调MKN-45细胞miR-122-5p表达。结论下调lncRNA SNHG7可通过上调miR-122-5p而降低CCND1表达,进而抑制胃癌细胞增殖,促进其凋亡,并减轻其免疫逃逸。

LncRNA-NEAT1调控miR-182-5p表达对狼疮性肾炎肾系膜细胞损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)核旁丛组装转录本1(NEAT1)在狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)中通过微小RNA(miR)-182-5p/叉头盒蛋白O1(FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)轴对肾系膜细胞损伤的影响。方法收集2019年3月至2021年7月凉山州第二人民医院收治的32例LN患者(LN组)外周血和32例体检健康者(健康对照组)外周血,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测外周血单个核细胞中NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β含量。采用20%LN患者血清处理肾系膜细胞的方法构建LN肾系膜细胞模型,造模完成后将细胞分为对照组(正常培养,不转染)、模型组(加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NC组(转染si-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1组(转染si-NEAT1后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-NC组(共转染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-182-5p组(共转染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5μg/mL脂多糖培养)。qRT-PCR法检测各组细胞NEAT1、miR-182-5p表达水平;ELISA法测定各组细胞炎症因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH含量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞增殖活力;流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况;免疫印迹法检测各组细胞FoxO1、β-catenin蛋白表达水平。结果与健康对照组比较,LN组患者外周血单个核细胞中NEAT1、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平以及血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著上升,miR-182-5p表达水平显著下降(P<0.05)。与对照组比较,模型组肾系膜细胞增殖活力、FoxO1和β-catenin蛋白水平以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显增加,miR-182-5p表达水平明显降低(P<0.05)。敲低NEAT1后,细胞增殖活力和炎症反应减弱,FoxO1和β-catenin蛋白表达明显下调(P<0.05);抑制miR-182-5p表达可减轻NEAT1敲低对LN肾系膜细胞模型细胞增殖、炎症因子及FoxO1、β-catenin蛋白表达的影响(P<0.05)。各组细胞间凋亡率无显著变化(P>0.05)。结论敲低NEAT1可通过靶向负调控miR-182-5p表达,抑制LN肾系膜细胞过度增殖,降低炎症反应,其可能与抑制FoxO1/β-catenin通路有关。

CircCCND1调节miR-340-5p/TGIF1轴对H446肺癌细胞恶性生物学行为的影响

背景与目的 肺癌是常见的肺部恶性肿瘤,探究肺癌发生发展的分子机制是当前研究的热点。环状RNA细胞周期蛋白D1 (circular RNA Cyclin D1,CircCCND1)在肺癌中高表达,可能是治疗肺癌的潜在靶点。本研究旨在探讨CircCCND1调节miR-340-5p/转化生长因子β诱导因子同源框1 (transforming growth factor β-induced factor homeobox 1,TGIF1)轴对肺癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 检测人正常肺上皮细胞BEAS-2B及人肺癌H446细胞中CircCCND1、miR-340-5p及TGIF1 mRNA表达。将体外培养的H446细胞分为对照组、CircCCND1 siRNA组、miR-340-5p mimics组、阴性对照组、CircCCND1 siRNA+miR-340-5p inhibitor组,检测细胞增殖、线粒体膜电位、凋亡、迁移和侵袭情况,以及各组细胞CircCCND1、miR-340-5p、TGIF1 mRNA、BCL2相关X蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)、剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶3 (cleaved Caspase-3)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、TGIF1蛋白表达,并验证miR-340-5p与CircCCND1、TGIF1的靶向关系。结果 与BEAS-2B细胞相比,H446细胞CircCCND1、TGIF1 mRNA升高,miR-340-5p表达降低(P<0.05)。敲低CircCCND1或上调miR-340-5p表达可抑制H446细胞增殖、迁移、侵袭,降低TGIF1 mRNA和TGIF1蛋白表达,促进细胞凋亡;下调miR-340-5p可拮抗敲低CircCCND1对H446肺癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。CircCCND1可能靶向下调miR-340-5p,miR-340-5p可能靶向下调TGIF1。结论 敲低CircCCND1可抑制肺癌H446细胞恶性行为,其作用可能是通过调控miR-340-5p/TGIF1轴实现的。

LINC00894通过miR-205-5p/ZEB1轴对胃癌细胞增殖和转移的影响

目的 探究长链非编码RNA 00894(LINC00894)基因对人胃癌细胞增殖、转移的影响,验证LINC00894、miR-205-5p、ZEB1在胃癌中的调控关系。方法 采用RT-qPCR检测LINC00894在胃癌细胞系、正常胃细胞系、临床胃癌及正常胃组织样本中的表达水平;通过随访,探究LINC00894的表达水平与胃癌患者预后的关系;构建LINC00894敲减细胞系和过表达细胞系,并采用RT-qPCR检测敲减及过表达效率;通过CCK-8、克隆形成和Transwell实验检测细胞增殖与转移能力;采用双荧光素酶报告实验、RT-qPCR实验和Western blot实验检测LINC00894、miR-205-5p和ZEB1的靶向调控关系。结果 LINC00894基因在胃癌组织或细胞中的表达量明显高于胃正常组织或细胞,且LINC00894基因高表达的胃癌患者预后更差;LINC00894基因的敲减抑制了胃癌细胞的活力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力,相反,LINC00894基因的过表达得到相反地结果;LINC00894通过靶向miR-205-5p并下调其表达,从而促进ZEB1的表达。结论 LINC00894在胃癌中扮演癌基因的角色,可能通过miR-205-5p/ZEB1轴促进胃癌细胞增殖和转移。

胃饥饿素通过miR-455-5p靶向IGF-1R调控肝细胞胰岛素敏感性的作用及机制研究

目的:探究胃饥饿素通过调控miR-455-5p影响肝细胞胰岛素敏感性的作用机制。方法:采用高糖构建HepG2细胞胰岛素抵抗模型,造模成功后使用去酰基化胃饥饿素(DAG,1μmol/L)干预,分别转染miR-455-5p模拟物(miR-455-5p mimic)或对照物(NC mimic)。检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量。采用荧光原位杂交分析HepG2细胞内miR-455-5p表达水平。应用生物信息学分析、荧光素酶报告基因实验来鉴定与miR-455-5p结合的靶基因,Western Blot检测IGF-1R/PI3K/Akt信号通路的表达水平。结果:在胰岛素抵抗HepG2细胞中,miR-455-5p的表达水平显著上调,葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量均明显降低。DAG干预后细胞葡萄糖消耗量和细胞内糖原含量增加,miR-455-5p的表达水平下调,IGF-1R/PI3K/Akt信号通路被激活。生物信息学分析表明IGF-1R是miR-455-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因检测、miR-455-5p模拟物和抑制剂转染证实DAG通过抑制miR-455-5p从而激活IGF-1R/PI3K/Akt信号通路。结论:DAG通过miR-455-5p介导的IGF-1R/PI3K/Akt信号通路激活并改善胰岛素抵抗,表明抑制miR-455-5p或外源性补充DAG可能是T2DM治疗的潜在靶点。

CircRTN4调节miR-224-5p/MYT1L轴对胶质母细胞瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨环状RNA(CircRNA)RTN4调节微小RNA(miR)-224-5p/髓磷脂转录因子1样(MYT1L)轴对胶质母细胞瘤(GM)细胞恶性生物学行为的影响。方法:以对数生长期的U251细胞进行设置分组:空白组、阴性对照(sh NC)组、沉默circRTN4 shRNA(sh circRTN4)组、sh circRTN4+抑制剂对照(inhibitor NC)组、sh circRTN4+miR-224-5p抑制剂(miR-224-5p inhibitor)组。Transwell实验、流式细胞术、CCK-8、qRT-PCR、Western blot以及双荧光素酶分别检测细胞迁移与侵袭、凋亡、增殖、CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达、增殖蛋白(ki-67)、凋亡蛋白(cleaved Caspase-3)、MYT1L蛋白表达以及miR-224-5p分别与CircRTN4、MYT1L靶向关系验证;qRT-PCR检测GM细胞系U118、U87、U251和LN229细胞及正常人星形胶质细胞系NHA细胞中CircRTN4、miR-224-5p、MYT1L mRNA表达水平。结果:U118、U87、U251和LN229细胞中CircRTN4、MYT1L mRNA表达较NHA细胞显著增加,miR-224-5p表达显著下降(P<0.05);miR-224-5p分别与CircRTN4、MYT1L的有靶向关系。与空白组、sh NC组相比,sh circRTN4组迁移、侵袭数、24h、48h A450值、ki-67、CircRTN4、MYT1L mRNA及蛋白表达显著降低,凋亡率、cleaved Caspase-3表达显著增加(P<0.05);与sh circRTN4+inhibitor NC组相比,sh circRTN4+miR-224-5p inhibitor组迁移、侵袭数、24h、48h A450值、ki-67、MYT1L mRNA及蛋白表达显著增加,凋亡率、cleaved Caspase-3表达显著下降(P<0.05),CircRTN4表达无统计学差异(P>0.05),体内实验证明干扰CircRTN4可显著抑制移植瘤裸鼠肿瘤质量(P<0.05)。结论:沉默CircRTN4调节miR-224-5p/MYT1L轴抑制GM细胞恶性生物学行为。

LncRNA LINC00665通过miR-9-5p调节ATF1表达促进甲状腺乳头状癌进展

目的 探究LncRNA LINC00665通过miR-9-5p调节转录激活因子(ATF)1表达,促进甲状腺乳头状癌(PTC)的进展。方法 收集手术切除的PTC组织及癌旁组织80例,qRT-聚合酶链反应(PCR)分析PTC组织及癌旁组织、PTC细胞系中LINC00665与miR-9-5p的相对表达,分析LINC00665与miR-9-5p在PTC中的相关性。B-CPAP细胞分为对照组、阴性对照组、shLINC00665组和shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组,进行对应转染。Target Scan Human预测和双荧光素酶报告基因检测分析LINC00665、ATF1和miR-9-5p的靶向调节关系。CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力,流式检测细胞凋亡,Western印迹检测PTC及癌旁组织ATF1和细胞ATF1、凝血酶敏感蛋白(TSP)-1、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,体内异种移植实验检测肿瘤发展能力,免疫组化检测肿瘤ATF1表达。结果 与癌旁组织相比,PTC组织中LncRNA LINC00665、ATF1表达量显著升高,LncRNA LINC00665与miR-9-5p水平呈显著负相关(P<0.05)。与Nthy-ori3-1相比,TPC-1、KTC-1、B-CPAP、HTori-3的LINC00665表达量均显著升高,miR-9-5p表达量均显著降低(P<0.05)。LINC00665与miR-9-5p、miR-9-5p与ATF1存在结合位点,LINC00665靶向抑制miR-9-5p, miR-9-5p靶向抑制ATF1。与对照组相比,shLINC00665组细胞增殖活性、迁移与侵袭能力、Bcl-2表达量、皮下肿瘤生长速度与ATF1表达量显著降低,凋亡率、TSP-1、Bax表达量显著升高(P<0.05);与shLINC00665组相比,shLINC00665+miR-9-5p-inhibitor组细胞增殖活性、迁移与侵袭能力、Bcl-2表达量、皮下肿瘤生长速度与ATF1表达量显著提升,凋亡率、TSP-1、Bax表达量显著下降(P<0.05)。结论 LncRNA LINC00665能够靶向调控miR-9-5p表达,降低miR-9-5p对ATF1的抑制,促进PTC发展。

CircFOXK2调节miR-330-5p/SLC1A5轴对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨CircFOXK2对卵巢癌(ovarian cancer, OC)细胞恶性生物学行为的影响以及在此过程中对miR-330-5p/SLC1A5轴的调节机制。方法:将人OC细胞系的SKOV3细胞分为NC组(未转染)、 si-CircFOXK2-NC组(转染si-CircFOXK2-NC)、si-CircFOXK2组(转染si-CircFOXK2)、 si-CircFOXK2+anti-miR-330-5p-NC组(转染si-CircFOXK2和anti-miR-330-5p-NC)、si-CircFOXK2+anti-miR-330-5p组(转染si-CircFOXK2和anti-miR-330-5p)。qRT-PCR检测细胞中CircFOXK2、miR-330-5p、SLC1A5 mRNA的表达;Western blot检测细胞中SLC1A5蛋白表达水平;CCK-8检测SKOV3细胞增殖;克隆形成实验检测SKOV3细胞克隆数量;流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡情况;Transwell小室实验测定SKOV3细胞迁移和侵袭能力;双荧光素酶报告基因实验和RNA pull-down实验验证CircFOXK2、miR-330-5p、SLC1A5三者的靶向关系。结果:与NC组和si-CircFOXK2-NC组相比,转染si-CircFOXK2组OC细胞中CircFOXK2、SLC1A5 mRNA水平及SLC1A5蛋白表达、细胞增殖活性、迁移和侵袭能力均降低(P<0.05),miR-330-5p的表达、细胞凋亡率均升高(P<0.05);anti-miR-330-5p回补实验结果显示,si-CircFOXK2+anti-miR-330-5p组细胞中SLC1A5 mRNA水平及SLC1A5蛋白表达升高,细胞增殖活性及迁移和侵袭能力降低(P<0.05)。结论:敲低CircFOXK2能够上调miR-330-5p表达,下调SLC1A5的表达,抑制OC细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。

脑胶质瘤组织lncRNA SOX21-AS1、miR-875-5p表达及其与患者预后的关系

目的探讨脑胶质瘤患者癌组织长链非编码RNA(lncRNA)SRY-box转录因子21反义RNA 1(SOX21-AS1)、miR-875-5p表达及其与患者预后的关系。方法选取2014年7月—2018年8月三门峡市中心医院脑胶质瘤患者77例(胶质瘤组),以颅脑损伤患者50例作为对照组。收集2个组经手术切除的脑胶质瘤组织和正常脑组织,测定组织中lncRNA SOX21-AS1、miR-875-5p相对表达量。采用Pearson相关分析评估lncRNA SOX21-AS1和miR-875-5p的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析脑胶质瘤患者的预后情况。采用Cox回归分析评估脑胶质瘤患者预后的影响因素。结果胶质瘤组lncRNA SOX21-AS1相对表达量高于对照组(P<0.001),miR-875-5p相对表达量低于对照组(P<0.001)。不同世界卫生组织(WHO)分级的脑胶质瘤患者lncRNA SOX21-AS1、miR-875-5p相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,脑胶质瘤组织中lncRNA SOX21-AS1相对表达量与miR-875-5p相对表达量呈负相关(r=-0.554,P<0.001)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,lncRNA SOX21-AS1低表达组、miR-875-5p高表达组累积生存率分别高于lncRNA SOX21-AS1高表达组、miR-875-5p低表达组(P<0.05)。多因素Cox回归分析结果显示,WHO分级和lncRNA SOX21-AS1均是脑胶质瘤患者不良预后的独立危险因素[风险比(HR)值分别为2.266、2.390,95%可信区间(CI)分别为1.452~3.536、1.496~3.818,P<0.001]。结论lncRNA SOX21-AS1和miR-875-5p均与脑胶质瘤患者预后密切相关,或可作为评估脑胶质瘤患者预后的有效指标。