miR-622抑制物对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响研究

目的研究miR-622抑制物(miR-622 inhibitor)对人乳腺癌细胞MCF-7增值、迁移与侵袭的影响。方法待对数生长期状态良好的人乳腺癌细胞MCF-7生长融合度达30%~50%时,使用Ribofactamine转染试剂将miR-622 inhibitor及miR-622阴性对照(miR-NC)分别转染到MCF-7细胞中,分组为miR-622 inhibitor组、miR-NC组及control组。采用qRT-PCR法分别检测3组MCF-7细胞中miR-622的表达水平,Western blot检测3组细胞中EYA1蛋白表达水平。同时采用CCK-8实验、伤口愈合实验、Transwell小室实验分析miR-622 inhibitor对MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果miR-622 inhibitor组中miR-622相对表达量低于control组及miR-NC组,EYA1蛋白相对表达水平高于control组和miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05);实验结果显示,miR-622 inhibitor组增殖能力、迁移率及侵袭细胞数均低于control组及miR-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-622低表达可能通过上调EYA1通路,实现降低乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平,抑制了癌细胞的转移。

miR-92b-3p抑制物在阿尔兹海默病并发癫痫动物模型中的抗癫痫效应

目的:评估miR-92b-3p抑制物在阿尔兹海默病(AD)并发癫痫动物模型中的抗癫痫效应。方法:通过生物信息学方法和双荧光素酶实验筛选解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)的调控分子,采用实时定量聚合酶链反应和Western Blot评估miR-92b-3p和ADAM10在神经元细胞和AD并发癫痫动物模型中的表达水平,经鼻腔给药方法给予miR-92b-3p的抑制物,评估其在AD并发癫痫动物模型中的抗癫痫效应。结果:通过生物信息学方法,双荧光素酶实验,Western Blot条带及其灰度分析,确认miR-92b-3p可转录后调控ADAM10,且在神经元细胞中对ADAM10调控作用较强。与AD动物模型组相比,miR-92b-3p在AD并发癫痫动物模型(AD+EP)组中显著上调。与AD+EP组相比,经鼻腔给予miR-92b-3p抑制物的治疗组癫痫发生率,Racine 4级以上发生率均显著减少。Racine 4级以上发作的潜伏期显著延长。结论:本研究初步证实miR-92b-3p抑制物在AD并发癫痫动物模型中具有抗癫痫效应。

miR-21抑制物对A549细胞球增殖的影响及机制

目的研究miR-21抑制物在A549细胞球增殖的作用及其相关机制。方法在无血清培养基中培养A549细胞球,形成细胞球后进行CD133+CD44+表达检测。实验分为A549细胞球组:未经处理;IHN组:miR-21抑制物转染A549细胞球组;IHN-NC组:miR-21抑制物阴性对照物转染A549细胞球组。Western印迹检测A549细胞和A549细胞球中DKK2、β-catenin蛋白以及QPCR检测miR-21在两种细胞中的表达;合成miR-21抑制物和阴性对照,分别转染A549细胞球48 h后,应用QPCR检测转染前后miR-21的表达变化,以及使用Western印迹分析DKK2、β-catenin蛋白的表达变化,利用噻唑蓝(MTT)检测12、24、48 h细胞的增殖能力。结果流式细胞术检测A549细胞球中CD133+CD44+阳性率为65.800%;IHN组miR-21的表达以及β-catenin蛋白的表达较A549细胞球组和IHN-NC组显著下调(P<0.05),而DKK2蛋白表达显著升高(P<0.05);MTT结果示IHN组和IHN-NC组在12、24、48 h时抑制率显著高于A549 sphere组(P<0.05),IHN组在24、48 h时相点抑制率明显高于IHN-NC组(P<0.05)。结论miR-21抑制物可有效抑制A549 sphere的增殖,其可能成为治疗肺癌的潜在靶点。

miR-7抑制剂治疗MRL/lpr小鼠的实验性研究

目的:探讨miR-7抑制剂治疗MRL/lpr小鼠的疗效。方法:选取30只MRL/lpr小鼠,随机分为miR-7抑制剂(miR-7 antagomir)组、环磷酰胺(CTX)组和生理盐水(Saline)对照组,10只/组。MRL/lpr小鼠13周时开始治疗,以上药物分别连续给药5周。每周观察各组小鼠一般状况并称重,留取血清和尿液标本。ELISA检测13~17周三组小鼠血清ANA、抗ds-DNA抗体、C3水平,并检测上述各周三组小鼠尿蛋白水平。流式细胞术检测三组小鼠Tfh细胞比例变化。RT-PCR检测三组小鼠脾脏和淋巴结miR-7和PTEN mRNA表达水平。HE、PAS、PASM染色观察光镜下三组小鼠的肾脏病理情况。结果:治疗5周后,形态学方面:与Saline组相比,miR-7 antagomir组和CTX组小鼠一般状况良好,体质量随周龄增加而增加。血清学方面:miR-7 antagomir组和CTX组血清ANA和抗ds-DNA抗体较Saline组明显下降,补体C3水平明显上升,但两治疗组间上述指标差异均无统计学意义。细胞学方面:miR-7 antagomir组小鼠脾脏Tfh细胞比例明显低于Saline组。与Saline组比较,miR-7 antagomir组小鼠脾B细胞miR-7表达水平降低,PTEN mRNA表达水平升高。此外,miR-7 antagomir组和CTX组小鼠光镜下肾脏病理改变均较Saline组有所好转,但该两组间肾脏病理改变无明显差异。结论:miR-7可作为系统性红斑狼疮的潜在治疗靶点,miR-7 antagomir能够显示出与经典免疫抑制剂CTX相近的治疗效果,有效地改善了MRL/lpr小鼠的狼疮样疾病表现,延缓了病情进展。

转染miR-27a抑制物对人肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的:观察miR-27a抑制物对肺癌A549/DDP细胞株增殖、凋亡及迁移能力的变化,探讨miR-27a抑制物对A549/DDP细胞顺铂耐药的影响。方法:将A549/DDP细胞随机分为miR-27a inhibitor组、阴性对照组和正常细胞对照组。miR-27a inhibitor组经miR-27a抑制物抑制miR-27a表达,阴性对照组转染miR-NC,正常对照组不处理。RT-PCR验证转染效率。加入顺铂(DDP)干预后,采用MTT比色实验测定DDP对三组细胞的IC50,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell法检测细胞迁移。结果:miR-27a inhibitor组miR-27a的表达被显著抑制(P<0.05)。DDP对转染miR-NC和空白对照细胞的IC50值明显高于转染miR-27a inhibitor的细胞(P<0.05)。转染miR-27a inhibitor的A549/DDP细胞联合DDP处理后细胞数目减少,体积减小,细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。Transwell法检测结果示miR-27a inhibitor组迁移力受到明显抑制(P<0.05)。结论:在A549/DDP细胞中,下调miR-27a的表达后,A549/DDP细胞对DDP的敏感性提高,凋亡程度增强,部分逆转了肺癌A549/DDP细胞的耐药性,为miR-27a与化疗联合治疗肺癌提供了可能的实验依据。

miR-137对卵巢癌的抑制作用及其机制

目的分析miR-137的表达对卵巢癌的抑制作用及可能的作用机制。方法采用正常卵巢上皮细胞株HOSE及人卵巢癌细胞株SKOV3、3AO、SW626,分析卵巢癌中miR-137的表达水平,研究其对卵巢癌抑制作用及可能的作用机制。结果与miR-137在正常卵巢上皮细胞HOSE表达水平比较,卵巢癌细胞3AO、SW626、SKOV3中表达水平明显依次下降(P <0. 05);通过Kaplan-Meier生存分析,卵巢癌中miR-137高表达的细胞生存期明显长于低表达(P <0. 05);靶基因双荧光素酶实验显示卵巢癌SW626、SKOV3分别转染的wt-EZH2 3'-UTR与mut-EZH2 3'-UTR载体48 h后,野生型wt-EZH2 3'-UTR的相对双荧光素酶活性明显低于突变型mut-EZH2 3'-UTR(P <0. 05);同时卵巢癌SW626、SKOV3分别经转染过表达miR-137明显降低EZH2基因mRNA水平及EZH2 mRNA蛋白水平的表达。Western Blot实验显示卵巢癌细胞miR-137降低EZH2蛋白的表达,通过过表达EZH2作用后EZH2蛋白的表达水平得到恢复(P <0. 05);克隆形成实验显示卵巢癌细胞miR-137过表达后克隆形成能力下降,通过过表达EZH2作用后克隆形成能力得到恢复(P <0. 05);同时经EdU检测提示卵巢癌SW626、SKOV3中miR-137抑制卵巢癌细胞的生长,通过EZH2过表达作用后可恢复卵巢癌细胞的生长能力。结论 miR-137高表达能够抑制卵巢癌细胞增殖,促进其凋亡,其可能的作用机制与miR-137下调EZH2表达水平有关。

肥胖患者外周血miR-155表达与非酒精性脂肪肝病发病的关系

目的研究肥胖患者外周血miR-155表达与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病的关系。方法选择2017年10月至2019年5月期间本院收治的94例单纯性肥胖患者作为肥胖组,另取50例超重患者及50例健康者作为超重组及对照组,检测外周血中miR-155、细胞因子信号转导抑制物1(SOCS1)、核因子-κB(NF-κB)的表达水平,评估肥胖组患者是否发生NAFLD。结果 3组外周血中miR-155、NF-κB的表达水平比较:肥胖组>超重组>对照组,差异有统计学意义(P<0.05);SOCS1表达水平比较:肥胖组<超重组<对照组,差异有统计学意义(P<0.05);肥胖组患者外周血中miR-155与SOCS1具有负相关关系(r=-0.384,P<0.05),与NF-κB具有正相关关系(r=0.427,P<0.05);肥胖组中NAFLD患者外周血中miR-155、NF-κB的表达水平显著高于非NAFLD患者,SOCS1的表达水平显著低于NAFLD患者,差异有统计学意义(P<0.05);肥胖组中"miR-155表达水平≥中位数患者"的ALT、AST、TC、TG、LDL-C、HDL-C、hs-CRP、F-INS、HOMA-IR水平均高于"miR-155表达水平<中位数患者",差异有统计学意义(P<0.05)。结论肥胖患者外周血中miR-155表达增加与NAFLD发病有关,调控SOCS1及NF-κB是miR-155参与NAFLD发病的可能机制。

miR-18a通过阻断TLR4/NF-κB通路减轻小鼠过敏性鼻炎的炎症和组织损伤

目的探究微小RNA-18a(miR-18a)在小鼠过敏性鼻炎发病过程中的作用。方法22只BALB/c小鼠被随机分为空白组、模型组及miR-18a组。模型组和miR-18a组小鼠采用腹腔注射卵清蛋白(OVA)混悬液的方法制备过敏性鼻炎模型,miR-18a组小鼠同时给予过表达miR-18a的慢病毒载体质粒。采用行为学评分及HE染色评价各组小鼠过敏症状及形态学变化,ELISA检测血浆白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,免疫荧光组织化学染色检测小鼠鼻黏膜组织CD45^(+)细胞浸润情况,流式细胞术检测鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量,荧光定量PCR检测鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,Western blot法检测鼻黏膜组织Toll样受体4(TLR4)、核因子κB p65(NF-κB p65)、NF-κB抑制物α(IκBα)、磷酸化的IκBα(p-IκBα)的蛋白表达。结果与空白组相比,模型组小鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著增高,鼻黏膜组织及鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量增多,鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及TLR4、NF-κB p65、p-IκBα表达水平升高;与模型组相比,miR-18a组小鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低,鼻黏膜组织及鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量减少,鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及TLR4、NF-κB p65、p-IκBα表达水平降低。结论miR-18a能够通过阻断TLR4/NF-κB通路抑制小鼠过敏性鼻炎的发生和发展。

miR-155-5p/SOCS1在大鼠角膜移植排斥反应中的作用

目的探讨miR-155-5p/细胞因子信号转导抑制物1(SOCS1)在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用及典必殊能否抑制miR-155-5p/SOCS1通路延缓排斥反应。方法建立大鼠角膜移植模型,随机分为对照组、自体移植组、同种异体移植组、同种异体移植+典必殊组(典必殊组)。术后每天按Larkin法行角膜植片排斥反应评分。术后第14天取各组大鼠术眼角膜,HE染色行组织病理学观察;RT-qPCR检测各组角膜组织中miR-155-5p表达;Western blot检测各组角膜组织中SOCS1蛋白表达。结果对照组和自体移植组角膜植片直至观察期结束均未发生排斥反应,同种异体移植组角膜植片存活时间为(12.25±0.33)d,典必殊组角膜植片存活时间明显延长至(27.08±1.78)d,差异有统计学意义(P<0.001)。HE染色结果显示同种异体移植组角膜可见大量炎症细胞及新生血管管腔结构;自体移植组、典必殊组仅有少量炎症细胞、新生血管管腔。RT-qPCR检测结果显示与对照组相比,自体移植组、同种异体移植组角膜miR-155-5p mRNA相对表达量均显著升高,同种异体移植组角膜miR-155-5p相对表达量显著高于自体移植组,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示与对照组相比,自体移植组角膜SOCS1蛋白相对表达水平明显升高;与自体移植组相比,同种异体移植组角膜SOCS1蛋白相对表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.001);与同种异体移植组相比,典必殊组大鼠角膜中miR-155-5p表达下降,SOCS1蛋白相对表达水平升高(P<0.001)。结论miR-155-5p/SOCS1参与大鼠角膜移植术后排斥反应,典必殊可通过阻断这一通路延缓排斥反应。

miR-916a调控SOCS6促进HBx-HepG2细胞生长

目的探讨HBx-HepG2细胞中miR-196a对细胞因子信号抑制物6(SOCS6)表达的调控作用以及对细胞生长的促进作用,并研究其潜在的分子作用机制。方法利用qRT-PCR检测miR-196a以及SOCS6 mRNA的表达水平;Western blotting检测SOCS6蛋白表达水平;CCK-8和集落形成实验检测细胞的生长;采用双荧光素酶报告实验验证miR-196a的靶基因。结果与正常人肝细胞(L02)相比,miR-196a在HBx-HepG2细胞中过量表达(P<0.05)。miR-196a过表达可促进HBx-HepG2细胞生长;miR-196a表达下调可抑制HBx-HepG2细胞生长,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常人肝细胞(L02)相比,SOCS6 mRNA在HBx-HepG2细胞中表达下调(P<0.05);miR-196a可以通过作用于SOCS6的3'UTR区负向调控其表达,并且SOCS6的过表达可以抑制HBx-HepG2细胞的生长。结论 miR-196a可以通过靶向负调控SOCS6基因进而促进HBx-HepG2细胞的生长。

miR-17-5p通过靶基因SOCS6促进口腔鳞癌细胞增殖的研究

目的:探讨miR-17-5p在口腔鳞癌发病中的作用和作用机制。方法:收集42例手术后病理诊断为口腔鳞癌(OSCC)组织标本,使用q RT-PCR测定miR-17-5p的表达;通过MTT实验、报告基因实验和Pearson相关性检验探讨miR-17-5p对OSCC的作用和调控机制。结果:在OSCC中miR-17-5p表达显著上调(P<0.05);MTT证实miR-17-5p可以促进肿瘤细胞增殖;报告基因实验证实,细胞因子信号抑制物-6(SOCS6)3'UTR区域存在一个miR-17-5p的结合位点,miR-17-5p通过该结合位点抑制SOCS6的m RNA水平和蛋白水平,进而促进细胞增殖;临床证实miR-17-5p与SOCS6表达呈明显负相关。结论:miR-17-5p在OSCC中表达明显上调,可能通过抑制其下游靶基因SOCS6参与了肿瘤的发生发展。

miR-19b通过靶向ARC促进心肌缺血再灌注损伤

目的 探索miR-19b通过靶向调节活性调节细胞骨架相关蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein, ARC)促进心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, I-RI)的作用及其机制。方法 选择健康雄性C57B/L6小鼠20只按照体重随机分为2组,正常对照组(假手术组)和心肌缺血再灌注损伤组(n=10)。离体水平,利用过氧化氢(HO)诱导心肌细胞损伤,分为正常对照组、过氧化氢处理组、过氧化氢+miR-19b组和过氧化氢+阴性对照组。利用Real-time PCR检测小鼠心肌和心肌细胞中miR-19b的表达水平;蛋白免疫印迹技术检测ARC蛋白表达水平;利用MTT检测细胞活力,采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的活性,分析心肌细胞损伤情况。构建miR-19b拟似物(miR-19b mimics)、miR-19b抑制物(AMO-miR-19b)、miR-19b拟似物的阴性对照(NC-miR-19b mimics)和miR-19b抑制物的阴性对照(NC-AMO-miR-19b),利用瞬时转染技术,将其转染至心肌细胞中,进行心肌细胞中的miR-19b的过表达和干扰,进而分析miR-19b对ARC蛋白表达的影响。结果 (1)miR-19b在缺血再灌住损伤小鼠心脏和HO诱导损伤的心肌细胞中表达上调(P<0.05);(2)miR-19b过表达加重HO诱导心肌细胞损伤(P<0.05);(3)ARC在心肌缺血再灌住损伤小鼠心脏表达下调(P<0.05);(4)miR-19b负性调控了ARC的表达(P<0.05)。结论 miR-19b能够通过负性调控ARC的表达从而促进心肌缺血再灌注损伤。