口腔鳞癌中miR-661的表达及其与增殖、凋亡的关系研究

目的检测口腔鳞癌中miR-661的表达,探讨其与细胞增殖和凋亡的相关性。方法收集我院收治的口腔鳞癌手术患者51例,留取肿瘤组织和距肿瘤边缘>2 cm的远端组织进行研究。采用实时荧光定量PCR检测肿瘤组织和远端组织中miR-661的表达;免疫组化法检测肿瘤组织中Ki67、Bcl-2和Bax的表达;Western blotting检测肿瘤组织中PCNA的表达。选择口腔鳞癌HSC-4细胞系,建立无关序列组(NC组)和miR-661 inhibitor组,通过集落形成实验观察细胞的克隆形成情况,Western blotting检测两组细胞中Ki67、PCNA、Bcl-2、Caspase-9和Bax的表达。结果肿瘤组织中miR-661的表达水平显著高于远端组织(P<0.05),其表达与肿瘤最大径、脉管累犯、淋巴结转移和TNM分期有明显相关性(P<0.05),而与性别、年龄、分化程度和炎症细胞浸润程度无明显相关性(P>0.05);此外,miR-661的表达与患者生存时间有明显相关性(P<0.05);进一步分析显示,miR-661与Ki67增殖指数、Bcl-2及PCNA表达水平均呈正相关(P<0.05),与Bax表达水平呈负相关(P<0.05)。与NC组相比,miR-661 inhibitor组细胞中Ki67、PCNA和Bcl-2表达均显著下调,克隆形成明显减少,Caspase-9、Bax表达均明显上调。结论 miR-661在口腔鳞癌中表达显著上调,可能与肿瘤的形成和进展有关,miR-661可能通过调节细胞的增殖和凋亡发挥作用,其表达水平可能与患者预后相关。

LncRNA AL133467.1作为miR-661的ceRNA抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭

长非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)在多种肿瘤中异常表达并参与肿瘤的发生发展。然而,众多lncRNAs在肿瘤的表达及功能尚未完全阐明。本文通过分析TCGT数据库113例正常乳腺组织和1109例乳腺癌组织发现,LncRNA AL133467.1在乳腺癌组织中低表达,并与乳腺癌患者的预后不良呈负相关;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果也发现,AL133467.1在乳腺癌细胞中表达明显低于正常乳腺上皮细胞。在相对低表达的乳腺癌细胞SKBR3和BT474中过表达AL133467.1,细胞计数和平板克隆结果发现,过表达AL133467.1能明显抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.01);细胞划痕和Transwell实验显示,与对照组相比,过表达AL133467.1的乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显降低(P<0.01)。miRDB数据库显示,AL133467.1与miR-661存在结合位点,miR-661可以靶向结合ErbB2受体酪氨酸激酶2传感器2(transducer of ERBB2,2,TOB2);qRT-PCR结果显示,miR-661在乳腺癌细胞中高表达,并且与乳腺癌患者的预后不良呈正相关(P<0.001);荧光素酶报告基因结果显示,AL133467.1与miR-661存在特异性结合(P<0.01),过表达AL133467.1能抑制乳腺癌细胞中miR-661的表达(P<0.0001);同时,转染miR-661 mimics能消除过表达AL133467.1对乳腺癌细胞的抑制侵袭作用(P<0.001);此外,qRT-PCR和Western印迹结果显示,过表达AL133467.1能上调TOB2的mRNA(P<0.0001)和蛋白质水平,同时转染miR-661 mimics乳腺癌细胞中TOB2的mRNA(P<0.0001)和蛋白质水平明显被抑制。综上所述,AL133467.1作为miR-661的竞争性RNA上调TOB2的表达,从而抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭。

circKEAP1通过影响miR-661/LIF轴促进骨肉瘤细胞增殖和迁移

目的:探讨环状RNA circKEAP1通过影响微小RNA-661(miR-661),进而调控白血病抑制因子(LIF)基因促进骨肉瘤细胞凋亡和迁移的作用及其机制。方法:采用RT-qPCR探究不同骨肉瘤细胞系和成骨细胞hFOB1.19对照中circKEAP1的表达量,并通过一代测序验证其成环剪切位点。通过PCR验证circKEAP1在互补DNA与基因组DNA中的表达,并探究其在放线菌素D作用下的降解速率。构建circKEAP1的小干扰RNA,敲减circKEAP1后通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估骨肉瘤细胞143B活力、凋亡和迁移的改变。萤光素酶报告基因实验评估circKEAP1与miR-661的结合情况。通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估miR-661抑制剂对circKEAP1敲减的影响。转录组测序结合生物信息学分析预测circKEAP1的下游靶基因,并通过萤光素酶报告基因实验评估miR-661与LIF的结合情况。通过CCK-8、流式细胞术和细胞迁移实验评估LIF过表达对circKEAP1敲减的影响。结果:RT-qPCR结果显示,与成骨细胞hFOB1.19相比,多种骨肉瘤细胞系高表达circKEAP1(P<0.01)。circKEAP1存在于互补DNA中,而不存在于基因组DNA中,并且相对于其母基因KEAP1具有更好的稳定性。敲减circKEAP1显著抑制了143B细胞的生长,促进其凋亡,增加其迁移能力(P<0.01)。萤光素酶报告基因实验结果显示circKEAP1能与miR-661结合(P<0.01)。miR-661抑制剂可逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力降低、凋亡增加和迁移能力减弱(P<0.01)。转录组测序结合生物信息学分析锁定下游靶基因LIF。萤光素酶报告基因实验结果显示miR-661能结合LIF(P<0.01)。RT-qPCR结果显示,敲减circKEAP1显著下调了LIF的mRNA水平(P<0.01)。在143B细胞中过表达LIF可逆转敲减circKEAP1介导的细胞活力降低、凋亡增加和迁移能力减弱(P<0.01)。结论:环状RNA circKEAP1能吸附miR-661,进而调控其下游靶基因LIF。circKEAP1-miR-661-LIF轴可能在骨肉瘤细胞的发生与进展中发挥重要作用。

miR-661靶向SCARB1调控冠状动脉内皮细胞胞吞LDL的机制研究

目的探讨miRNA如何介导清除剂受体B类成员1(SCARB1)调控冠状动脉(冠脉)内皮细胞胞吞低密度脂蛋白(LDL)。方法通过siRNA和过表达载体改变SCARB1在冠脉内皮细胞中的表达,检测冠脉内皮细胞胞吞天然LDL(nLDL)和循环氧化的LDL(oxLDL)的情况。将miRDB和HumanTargetScan预测的SCARB1潜在miRNA和已经发表的冠脉内皮细胞存在的miRNA取交集后筛选SCARB1潜在的miRNA。通过荧光素酶报告系统检测miRNA是否靶向SCARB1。结果敲低SCARB1后,冠脉内皮细胞胞内的nLDL和oxLDL均减少(P<0.05)。过表达SCARB1后,冠脉内皮细胞胞内的nLDL和oxLDL均升高(P<0.05)。将miRDB和HumanTargetScan数据库中预测的SCARB1的miRNA和已发表的冠脉内皮细胞的总miRNA表达谱做交集后,发现有6个miRNA分别是miR-328-5p,miR-661,miR-4306,miR-4650-5p,miR-5586-3p,miR-6885-5p。过表达相应的miRNA后,仅在过表达miR-661时冠脉内皮细胞中SCARB1的表达水平降低(P<0.05)。敲低miR-661后,冠脉内皮细胞中SCARB1的表达水平升高(P<0.05)。此外,miR-661靶向SCARB1的3端非编码区(P<0.05)。过表达miR-661后,冠脉内皮细胞nLDL和oxLDL的水平均降低(P<0.05),而敲低miR-661后,冠脉内皮细胞nLDL和oxLDL的水平均升高(P<0.05)。同时过表达miR-661和SCARB1后,冠脉内皮细胞nLDL和oxLDL的水平无明显变化(P>0.05)。结论miR-661通过靶向SCARB1 mRNA的3端非编码区降解SCARB1 mRNA后减少了SCARB1的翻译,最终抑制冠脉内皮细胞胞吞LDL。

miR-661靶向HTRA1对结肠癌SW620细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨miR-661靶向高温必需蛋白A1(HTRA1)对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法收集2016年3月至2018年3月在廊坊市人民医院确诊的85例结肠癌患者肿瘤组织及其配对的癌旁组织。RT-qPCR检测结肠癌组织、癌旁组织、结肠癌细胞(SW620、SW480、HCT116、LoVo)、结肠上皮细胞(NCM460)中的miR-661及HTRA1 mRNA表达水平,Western blot检测结肠癌组织、癌旁组织、结肠癌细胞(SW620、SW480、HCT116、LoVo)、结肠上皮细胞(NCM460)中HTRA1的蛋白表达水平。根据不同转染方法将SW620细胞分为anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-661组(转染anti-miR-661)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-HTRA1组(转染pcDNA-HTRA1)、anti-miR-661+si-NC组(转染anti-miR-661和si-NC)、anti-miR-661+si-HTRA1组(转染anti-miR-661和si-HTRA1)和对照组(正常培养SW620细胞)。利用TargetScan在线预测、荧光素酶报告基因实验以及Western blot验证miR-661和HTRA1的靶向关系。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、Transwell实验检测SW620细胞增殖、迁移和侵袭变化。两组比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunne-t检验。miR-661或HTRA1的表达与各临床病理参数的关系分析采用c2检验。结果与癌旁组织比较,结肠癌组织中miR-661表达升高,HTRA1 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与NCM460细胞比较,SW620、SW480、HCT116、LoVo细胞中miR-661表达均升高,HTRA1 mRNA和蛋白表达水平降低(P均<0.05)。miR-661靶向HTRA1并负性调控其表达。与anti-miR-661组比较,对照组、anti-miR-NC组SW620细胞增殖活力(0.49±0.04比0.76±0.06、0.72±0.07)、迁移[(48.93±5.28)个比(98.67±8.57)个、(95.14±9.36)个]和侵袭数量[(36.48±4.87)个比(88.48±8.64)个、(81.65±8.36)个]升高(P均<0.05),而对照组与anti-miR-NC组之间上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。与pcDNA-HTRA1组比较,对照组、pcDNA组SW620细胞增殖活力(0.55±0.05比0.76±0.06、0.74±0.07)、迁移[(56.87±5.32)个比(101.65±9.87)个、(98.69±9.33)个]和侵袭数量[(43.28±4.37)个比(87.21±8.98)个、(85.91±8.42)个]升高(P均<0.05),而对照组与anti-miR-NC组之间上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。与anti-miR-661+si-NC组比较,anti-miR-661+si-HTRA1组SW620细胞增殖活力(0.48±0.04比0.62±0.06)、迁移数量[(47.58±4.72)个比(82.36±8.21)个和侵袭数量(36.98±3.66)个比(71.54±7.16)个]升高(P均<0.05)。结论在结肠癌中miR-661呈高表达,HTRA1呈低表达。抑制miR-661通过上调HTRA1可抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。