miR-370-3p在绵羊中的表达、生物信息学分析与靶基因预测

本研究以新吉细毛羊和小尾寒羊为实验动物,用实时荧光定量PCR检测miR-370-3p在绵羊不同组织中的表达变化;利用Mega11.0对miR-370-3p进行序列分析,并构建进化树;利用miRBase对脊椎动物的miR-370-3p序列进行检索,使用Ensembl数据库对miR-370-3p进行定位;利用在线网站预测miR-370-3p的靶基因,并进行GO、KEGG分析。组织表达结果显示,miR-370-3p在2种绵羊1月份和10月份的皮肤组织中均存在显著差异;在2种绵羊同组织间均存在显著差异。miR-370-3p序列主要存在于哺乳动物,且在不同物种间高度保守;miR-370-3p共有315个靶基因;GO分析结果显示靶基因主要富集在蛋白质的自磷酸化、细胞核与细胞质的运输、神经元凋亡过程等方面;KEGG通路分析表明靶基因主要富集到MAPK信号通路、寿命调节通路和细胞内吞作用等,其中多个与毛囊生长发育相关的基因富集到相关通路之上。绵羊miR-370-3p在皮肤组织存在时空表达差异,在各组织间广泛表达,可能通过靶向MAPK信号通路及寿命调节等通路参与调控毛囊的生长发育。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

miR-208b-3p通过抑制线粒体基因表达加重心力衰竭小鼠能量代谢障碍

目的探究miR-208b-3p对主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)诱导的心力衰竭小鼠能量代谢的作用及机制。方法将24只小鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组,n=6)和手术组(n=18)。手术组采用TAC建立心力衰竭模型;假手术组采用TAC相同手术方式,但不结扎主动脉弓。于TAC术后第2周再随机分为Antagomir组(n=6)、Antagomir-NC组(n=6)及TAC组(n=6),Antagomir组、Antagomir-NC组尾静脉分别注射miR-208b-3p antagomir(800μg)及miR-208b-3p antagomir阴性对照(800μg)试剂,每周2次,连续4周。术后第6周行超声心动图评估各组小鼠心功能。HE染色及天狼星红染色观察小鼠心肌组织病理学形态。ATP检测试剂盒检测各组小鼠心肌组织ATP水平。RT-qPCR检测小鼠心肌组织miR-208b-3p、线粒体基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、CO1、CO2、CO3、CYTB、ATP6、ATP8)及POLRMT、12SrRNA的表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-208b-3p与潜在靶基因POLRMT的相互结合作用。Western blot检测心肌组织POLRMT及ND1、CO2、CYTB、ATP8蛋白表达水平。结果与Sham组相比,TAC组小鼠心肌miR-208b-3p表达显著增加(P<0.05)。超声检测结果显示,Antagomir组小鼠心脏的射血分数、收缩与舒张功能较TAC组明显改善(P<0.05)。组织切片染色提示,Antagomir组小鼠的心肌细胞肥大、排列紊乱、心肌间质炎细胞浸润等有明显改善(P<0.05)。与TAC组相比,Antagomir组ATP水平明显升高(P<0.05);POLRMT及线粒体基因转录产物(12SrRNA和13个线粒体基因编码多肽)表达量均显著升高(P<0.05),但SDHA、SDHB无变化。双荧光素酶报告基因实验显示miR-208b-3p与POLRMT的CDS区有结合作用。Antagomir组小鼠心肌组织POLRMT、ND1、CO2、CYTB、ATP8蛋白水平表达较TAC组显著增加(P<0.05)。结论miR-208b-3p可通过靶向POLRMT抑制线粒体基因的表达,加剧线粒体能量代谢障碍,并加重心力衰竭小鼠心功能不全及心室重塑。

miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

猪miR-192靶向调控Wnt7a基因表达的研究

【目的】鉴定猪miR-192与Wnt家族成员7A(Wnt7a)基因之间的靶向关系,为进一步构建miR-192介导的胚胎通讯提供依据。【方法】使用miRNA pull-down鉴定miR-192和Wnt7a基因间的互作关系;利用生物信息学软件RNAhybrid 2.2预测miR-192和Wnt7a基因3′-UTR的结合位点,构建含有miR-192结合位点的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型基因片段,克隆至双荧光素酶报告基因质粒,通过NotⅠ、XhoⅠ酶切和测序进行鉴定;鉴定成功的质粒分别与miR-192 mimics和mimics NC共转染猪子宫内膜上皮细胞,检测双荧光素酶活性;将miR-192 mimics、mimics NC、miR-192 inhibitor、inhibitor NC分别与构建的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒共转染至猪子宫内膜上皮细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测Wnt7a基因mRNA和蛋白的表达水平。【结果】pull-down结果显示,miR-192 mimics组与其阴性对照组相比,Wnt7a基因相对表达量极显著升高(P<0.01),miR-192 input组相对于其阴性对照组极显著降低(P<0.01);RNAhybrid 2.2软件预测到miR-192种子区与Wnt7a基因3′-UTR存在结合位点(UGACCUA);转染Wnt7a野生型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组相比双荧光素酶活性显著降低(P<0.05),转染Wnt7a突变型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组之间双荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,miR-192 mimics组Wnt7a基因mRNA相对表达量显著低于其阴性对照组(P<0.05),miR-192 inhibitor组显著高于其阴性对照组(P<0.05)。Western blotting结果表明,过表达miR-192极显著抑制了Wnt7a蛋白的表达(P<0.01),抑制miR-192后Wnt7a蛋白的表达量极显著上升(P<0.01)。【结论】miR-192能够与Wnt7a基因3′-UTR发生靶向作用并抑制其表达。研究结果可为今后深入研究miR-192在妊娠着床过程中的调控机制提供理论依据。

牛miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达及其生物学功能分析

牛miR-17~92基因簇由6个不同的功能miRNAs组成,参与牛睾丸发育与精子发生。本研究从牛基因组中获得miR-17~92基因簇序列信息进行物种保守性分析,再采用半定量PCR的方法检测miR-17~92基因簇前体miRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾及不同活力精子中的表达水平,利用miWalk、TargetScan 7.2及miRTarBase 8.0等在线网站预测成熟miRNA的靶基因,并利用KOBAS3.0对预测靶基因进行GO和KEGG通路分析。结果表明,牛miR-17~92基因簇在哺乳动物进化中具有保守性,该基因簇的6个miRNA前体在睾丸组织中呈现高表达,均显著高于附睾组织;而这6个miRNA前体在附睾的不同位置也具有表达差异,其中pre-miR-19a在附睾尾中表达显著高于附睾体和附睾头,pre-miR17和pre-miR20a在附睾中未检测到表达;在不同活力精子中,高活力精子的bta-miR-17-5p、bta-miR-18、bta-miR-20a的表达水平显著高于低活力精子;生物信息学分析结果表明,6个miRNA一共预测到2 940个靶基因,这些靶基因主要通过MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路等参与调控牛睾丸功能。本研究分析了miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达分布,为miR-17~92基因簇对牛睾丸发育和调控精子活力的作用机制研究提供参考依据。

CREM基因在miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中的表达研究

目的:探讨miR-199b-5p基因敲除对雄性小鼠精液和睾丸中CREM表达水平的影响。方法:选miR-199b-5p基因敲除(KO)雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠。观察2组小鼠体重和睾丸指数。HE染色观察睾丸结构变化。显微镜下观察精子形态及计数精子浓度。数据库预测CREM与miR-199b-5p的靶向关系。RT-qPCR和Western印迹法分别检测2组小鼠睾丸中CREM mRNA和蛋白表达水平变化。结果:两组之间小鼠体重和睾丸指数无明显变化;与WT组比较,KO组小鼠精液精子计数稍下降,但无统计学差异(P>0.05);精液涂片示KO组精子浓度较WT组稀疏,但无统计学差异(P>0.05);睾丸病理示:与WT组比较,KO组睾丸体积较小,睾丸组织正常,生精小管可见各级生精细胞和支持细胞,生精小管界膜、管径无明显异常;数据库预测CREM基因是miR-199b-5p的靶基因;RT-qPCR结果示:与WT组比较,KO组雄鼠精液和睾丸组织中CREM mRNA表达水平均明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。Western印迹结果显示:与WT组比较,KO组雄鼠睾丸组织中CREM蛋白表达水平明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。随访半年,统计两组雄性小鼠出生数,发现KO组雄鼠的出生数较WT组明显下降(P<0.05)。结论:miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中CREM基因表达下调,推测miR-199b-5p可能靶向作用于CREM基因进而影响雄性小鼠的生育功能。

山羊miR-141靶基因预测及生物信息学分析

【目的】探究miR-141在动物机体糖脂代谢和骨代谢中的调控机制,为糖尿病合并骨质疏松症动物模型构建及相关基因表达调控机制研究提供依据。【方法】利用miRbase数据库获取不同物种miR-141成熟序列,通过BioEdit及WebLogo软件进行序列比对及保守性分析;利用PROMO及JASPAR在线软件对山羊miR-141启动子区转录因子结合位点进行预测;利用TargetScan和miRwalk数据平台对miR-141靶基因进行预测;利用DAVID和KOBAS在线软件对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用Networkanalyst数据库建立miRNA靶基因蛋白互作网络并绘制网络调控图;通过YM500V2在线数据库分析miR-141在山羊不同组织中的表达情况。【结果】miR-141成熟序列在不同物种间高度保守;山羊miR-141启动子区分布有转录因子C/EBPα、MyoD、YY1和Sp1等结合位点;选用不同数据库预测到Nfatc2、Egr2和Fasl等89个靶基因。GO功能富集分析发现,靶基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控与转录DNA模板等生物过程、细胞核与细胞质等细胞组分、蛋白结合与DNA结合等分子功能。KEGG通路富集显示,靶基因主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞紧密连接、轴突引导、Hedgehog信号通路、cGMP-PKG信号通路与癌症中的microRNA等。miR-141靶基因蛋白互作分析显示,Nfatc2和Egr2基因由Fasl基因连接,构成与其他蛋白相对复杂的靶向关系,这些关键基因参与了与机体糖脂代谢及骨代谢相关的TGF-β、Hedgehog及Wnt/β-catenin等多条信号通路。miR-141在山羊多种组织中均有表达,其表达水平具有组织差异性。【结论】miR-141可通过靶向Nfatc2、Egr2和Fasl基因参与调节Hedgehog及Wnt/β-catenin等多条信号通路,并进一步调控山羊糖脂代谢、肌肉骨骼系统生理生化反应。

静原鸡miR-2954的靶基因预测及生物信息学分析

为了预测静原鸡miR-2954的靶基因,并分析miR-2954在静原鸡不同组织的表达差异,探索其在静原鸡肌肉组织生长发育中的调控机制,试验采用生物信息学方法对比miR-2954成熟序列,并分析其保守性,使用TargetScan、miRDB、miRmap在线工具预测其靶基因,对靶基因集合进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,并采用实时荧光定量PCR方法对miR-2954的组织表达水平进行研究。结果表明:miR-2954序列在鸟类间高度保守,靶基因GO功能条目主要集中在RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调节、信号转导、RNA聚合酶Ⅱ对转录的负向调节、氧化-还原过程、免疫反应和G-蛋白偶联受体信号转导途径等,存在于细胞核、胞浆、外泌体等多个组分中,在ATP结合、锌离子结合、金属离子结合、蛋白质结合等分子功能中也发挥作用。靶基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体的相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞黏附分子、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、胰岛素信号传递途径与脂肪细胞因子信号传递途径等信号通路。miR-2954在静原鸡公鸡肺脏、肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在静原鸡母鸡肺脏、肾脏、胸肌、腿肌中的相对表达量极显著高于其他器官(P<0.01)。说明miR-2954可通过调节其靶向基因影响静原鸡的生长发育。

miR-145基因多态性与脑梗死的关系及对miR-145水平的影响

目的探讨miR-145基因rs41291957、rs353291位点多态性与脑梗死(IS)的关系及对miR-145水平的影响。方法收集2021年1-12月百色市人民医院收治的253例IS患者(IS组)及同期在该院体检中心体检的275例健康者(对照组)血液标本,采用TaqMan探针法SNP分型技术检测rs41291957、rs353291多态性,采用SYBR Green实时荧光定量PCR检测miR-145水平。比较两组miR-145水平,以及rs41291957、rs353291多态性分布情况,分析rs41291957、rs353291位点不同基因型患者miR-145水平差异。结果miR-145基因rs41291957、rs353291位点在IS组和对照组中均存在AA、AG、GG 3种基因型,且这两个位点在IS组和对照组中的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(均P>0.05),具有群体代表性。miR-145基因rs41291957、rs353291位点的基因型和等位基因在IS组与对照组中的分布频率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。IS组患者外周血单个核细胞中miR-145水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。但无论是IS组或对照组,组内rs41291957、rs353291位点不同基因型之间的miR-145水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论miR-145基因的rs41291957、rs353291位点多态性与IS易感性无关。虽然IS患者的外周血单个核细胞中miR-145水平明显升高,但是rs41291957、rs353291位点多态性对miR-145水平不具有调节性。

CYP2C19基因多态性、miR-374b-5p与ACI患者神经功能缺损和近期预后的关系

目的探讨细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因多态性、血清miR-374b-5p水平与急性脑梗死(ACI)患者神经功能缺损和近期预后的关系。方法选取2019年1月—2022年12月郑州市第七人民医院ACI患者164例,收集所有患者的一般资料,并检测CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p相对表达量。采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估ACI患者神经功能缺损程度。根据治疗15 d后的NIHSS评分将ACI患者分为预后良好组和预后不良组。采用Spearman相关分析评估miR-374b-5p与入院时NIHSS评分的相关性。采用多因素Logistic回归分析评估ACI患者近期预后不良的危险因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p判断ACI患者近期预后的效能。结果164例ACI患者CYP2C19基因型中,GG型(野生纯合子)26例(15.86%)、GA型(突变杂合子)66例(40.24%)、AA型(突变纯合子)72例(43.90%)。A等位基因频率为64.02%,G等位基因频率为35.98%。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=2.620,P=0.106)。GG基因型、GA基因型、AA基因型的ACI患者入院时NIHSS评分依次升高(P<0.001)。血清miR-374b-5p相对表达量与入院时NIHSS评分呈负相关(r_(s)=-0.510,P<0.001)。ACI患者预后不良发生率为19.51%(32/164)。预后不良组与预后良好组之间年龄、梗死体积、发病至就诊时间、白细胞(WBC)计数、CYP2C19基因型为AA型所占比例和血清miR-374b-5p相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。梗死体积、发病至就诊时间、WBC计数、CYP2C19基因型为AA型均是ACI患者预后不良的危险因素(P<0.05),miR-374b-5p相对表达量为保护因素(P=0.007)。AA基因型和血清miR-374b-5p单项检测和联合检测判断ACI患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.631、0.730、0.802。结论CYP2C19基因多态性、血清mi R-374b-5p相对表达量均与ACI患者神经功能缺损有关,或可作为ACI患者近期预后的评估指标。

德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p基因及其脂类代谢靶基因表达研究

试验旨在探究德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p基因及其靶基因的表达规律。选取饲养条件相同、同一胎次、年龄相近、处于泌乳中期的健康德宏奶水牛,分为高乳脂率组(H组)、中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)。每组选取3头奶水牛,屠宰后采集乳腺组织,提取总RNA。采用生物信息学方法预测miR-21-5p的靶基因。利用荧光定量PCR技术检测miR-21-5p及其靶基因的表达水平,并与课题组前期测定的乳脂率进行相关性分析。结果显示,miR-21-5p的靶基因可能为AGPAT6和GPAM。L组德宏奶水牛乳腺组织中miR-21-5p的表达水平高于M组和H组(P<0.01)。相关性分析结果显示,miR-21-5p与靶基因AGPAT6的表达水平呈极显著负相关(P<0.01),与靶基因GPAM的表达水平呈显著负相关(P<0.05),德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p表达量与乳脂率呈显著负相关(P<0.05),靶基因AGPAT6和GPAM与乳脂率呈极显著正相关(P<0.01)。蛋白互作网络结果显示,AGPAT6和GPAM互作关系最强。研究表明,miR-21-5p可能通过负调控靶基因AGPAT6和GPAM的表达影响乳脂合成,进而影响乳脂率。

大果木姜子油调控miR-328基因抗心律失常H9c2细胞的机制研究

目的:探讨大果木姜子油通过调控miR-328基因抗心律失常H9c2细胞的可能机制。方法:慢病毒转染构建miR-328过表达H9c2细胞株,再运用生物机能实验系统构建H9c2细胞和miR-328过表达H9c2细胞心律失常模型。将H9c2细胞分为正常对照组、模型组、大果木姜子油组、miR-328过表达组和miR-328过表达+大果木姜子油组。根据分组条件培养结束后,qPCR检测H9c2细胞中miR-328相对表达量;ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β含量;比色法检测SOD活性和MDA浓度;DCFH荧光探针检测ROS水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot检测H9c2细胞L型钙通道相关蛋白表达。结果:成功构建H9c2细胞和miR-328过表达H9c2细胞心律失常模型。与正常对照组比较,模型组和miR-328过表达组细胞TGF-β、SOD活性及CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、miR-328及CaV1.2蛋白表达和IL-1β、IL-6、MDA、ROS水平显著升高(P<0.01)。经大果木姜子油干预后,心律失常模型细胞形态改善,上述指标均被显著逆转(P<0.01)。结论:大果木姜子油可改善心律失常H9c2细胞,其作用机制可能与调控miR-328基因降低炎症因子水平、调节氧化应激、抑制细胞凋亡及调节L型钙通道相关蛋白表达有关。

miR-146a通过调节IPr1基因对结核分枝杆菌感染的AEC Ⅱ型细胞活性作用机制

目的 探讨miR-146a通过调节IPr1基因观察对结核分枝杆菌(Mtb)感染的肺泡II型上皮细胞(AEC II)活性的作用机制。方法 采用Mtb感染AECⅡ细胞。将AECⅡ细胞分为结核组(感染Mtb)、 NC组(模型+转染miR-146a NC)、转染组(模型+转染miR-146a mimics)。RT-PCR检测AECⅡ细胞miR-146a、Ipr1基因表达;CCK8检测AECⅡ细胞增殖;流式细胞仪检测AECⅡ细胞凋亡;双荧光素酶报告测定Ipr1与miR-146a靶向关系。结果 DIO荧光染色的Mtb在感染人AECⅡ细胞12 h内会进入细胞质基质中,并围绕细胞核分布,表明建立的结核分枝杆菌感染模型成功;结核组与NC组AECⅡ细胞中miR-146a、Ipr1基因表达比较无差异(P>0.05),与NC组相比,转染组AECⅡ细胞中miR-146a、Ipr1基因表达水平升高(P<0.05);结核组与NC组AECⅡ细胞在不同时间点的OD值比较均无差异(P>0.05),与NC组相比,转染组AECⅡ细胞在不同时间点的OD值均升高(P<0.05);结核组AECⅡ细胞凋亡率与NC组相比无差异(P>0.05),与NC组相比,转染组AECⅡ细胞凋亡率显著降低(P<0.001)。双荧光素酶报告结果显示,转染miR-146a后野生型Mtb感染的AECⅡ细胞中Ipr1活性升高(P<0.05),突变型Mtb感染的AECⅡ细胞中Ipr1活性无明显变化(P>0.05),表明Ipr1是miR-146a的靶基因。结论 过表达的miR-146a可增加Mtb感染的AECⅡ细胞活性,降低凋亡,研究机制认为可能与通过激活Ipr1水平相关。Ipr1是miR-146a靶基因,可通过激活表达而发挥减少Mtb对AECⅡ细胞活性的损伤。

外泌体介导的miR-663a通过调控TGF-β1/Smad信号通路影响结肠癌细胞侵袭和迁移

目的探讨外泌体介导的miR-663a通过调控转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响。方法从人骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液上清中分离外泌体,透射电子显微镜观察外泌体结构,Western印迹检测外泌体中CD63、CD81蛋白表达;将miR-NC、miR-663a mimics分别转染于外泌体,并分组为:EXO组(未转染的外泌体)、EXO-miR-NC组、EXO-miR-663a组,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组外泌体中miR-663a的表达;将上述各组外泌体分别与SW480细胞共培养,并分别命名为SW480+EXO组、SW480+EXO-miR-NC组、SW480+EXO-miR-663a组,在SW480+EXO-miR-663a组中加入TGF-β1/Smad信号通路激活剂SRI-011381,命名为SW480+EXO-miR-663a+SRI组,另取SW480细胞记为SW480组作为对照,激光共聚焦显微镜观察SW480细胞内吞外泌体;Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;Western印迹检测各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达。结果透射电子显微镜观察到BMSC细胞的外泌体均呈现出直径为30~100 nm的囊泡状结构,Western印迹结果表明,CD63和CD81蛋白在BMSC细胞的外泌体中高表达,而在细胞裂解液中几乎不表达;EXO组中miR-663a的表达水平显著高于BMSC细胞(P<0.05);与EXO组和EXO-miR-NC组比较,EXO-miR-663a组中miR-663a的表达水平显著升高(P<0.05);激光共聚焦显微镜结果显示,PKH26标记红色荧光的外泌体主要位于SW480细胞胞质内,并分布在核周围,大部分SW480细胞可见到红色荧光信号;与SW480组比较,SW480+EXO组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著降低(P<0.05);与SW480+EXO组和SW480+EXO-miR-NC组比较,SW480+EXO-miR-663a组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达进一步显著降低(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a+SRI组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著高于SW480+EXO-miR-663a组(P<0.05)。结论外泌体介导的miR-663a通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移。

miR-535靶向GAB2基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进山羊颗粒细胞增殖

【背景】MicroRNA(miRNA)是长度为18—25 nt的短RNA分子,在哺乳动物卵巢颗粒细胞调控卵泡发育过程中起着重要作用。团队前期对云上黑山羊高、低产羔数个体卵巢转录组测序结果显示,miR-535能够影响山羊产羔数,但具体调控机制尚不清楚。【目的】通过研究miR-535靶向GAB2(GRB2 associated binding protein 2)及其相关信号通路PI3K/AKT对山羊颗粒细胞增殖的影响,进一步探讨其分子生物学调控机制。【方法】在本研究中,选择具有两胎以上产羔记录的高、低产云上黑山羊各3只,同期发情处理后采集卵泡期卵巢组织,收集原代颗粒细胞。使用荧光定量PCR(reverse transcription-quantitativePCR,RT-qPCR)检测miR-535和GAB2在云上黑山羊高、低产卵巢组织中的表达量。构建GAB2的过表达/干扰载体,使用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、CCK8、EdU和细胞凋亡检测候选基因GAB2对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。使用miRDB和miRanda软件预测miR-535和GAB2的靶向关系,构建GAB2的野生型和突变型载体,利用双荧光素酶活性检验检测miR-535和GAB2的靶向关系。构建过表达/干扰miR-535载体,探究其颗粒细胞增殖及下游基因功能的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,GAB2在高产云上黑山羊卵巢组织中的表达量显著低于低产个体,miR-535的表达则相反(P<0.05);随后,RT-qPCR和Westernblot结果表明,在颗粒细胞中过表达GAB2后,CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著升高(P<0.05),BAX的表达量显著降低(P<0.05),抑制其表达则与之相反;EdU和CCK8检测显示,GAB2过表达后显著促进颗粒细胞增殖(P<0.05),抑制其表达后则相反;双荧光素酶报告试验表明,miR-535抑制了GAB2基因3’UTR区域的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示,在颗粒细胞中过表达miR-535后,GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著降低(P<0.05),BAX的表达量显著升高(P<0.05),抑制其表达后则与之相反;EdU和CCK8检测显示,miR-535过表达后抑制颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反;细胞凋亡试验表明,miR-535过表达后促进颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反。在颗粒细胞中抑制miR-535后,发现PI3K/AKT信号通路标志因子AKT1的表达水平显著升高(P<0.05)。【结论】miR-535通过抑制GAB2的表达,抑制了山羊颗粒细胞的增殖,为进一步探究miR-535调控山羊颗粒细胞的生物学功能提供了理论依据。

LncRNA GNAS-AS1通过调节miR-449a/Notch1轴参与胃癌细胞的增殖和迁移

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)GNAS反义RNA1(GNAS-AS1)通过调节miR-449a/缺刻基因1(Notch1)轴对胃癌(GC)细胞增殖和迁移的影响。方法收集四川省人民医院2013年9月至2017年9月30例确诊为GC的患者肿瘤组织与癌旁组织标本;将GC细胞AGS随机分为对照组(Control组)、si-NC组、si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组。实时荧光定量PCR检测GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表达;MTT实验、平板克隆形成实验检测增殖;wound healing实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭。Western Blot检测Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-449a和GNAS-AS1、Notch1的关系。结果与癌旁组织相比,肿瘤组织中GNAS-AS1、Notch1 mRNA表达升高,miR-449a表达降低(P<0.05)。与Control组、si-NC组相比,si-GNAS-AS1组AGS细胞GNAS-AS1表达、OD_(490)值、克隆形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin蛋白表达表达降低,miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。与si-GNASAS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组相比,si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组OD_(490)值、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin表达升高(P<0.05),miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。GNAS-AS1靶向负调控miR-449a表达,miR-449a靶向负调控Notch1表达。结论沉默GNAS-AS1可能通过上调miR-449a来抑制Notch1蛋白的表达,从而抑制GC细胞增殖、迁移、侵袭过程。

miR-381-3p在宫颈癌中靶基因及信号通路的分析

目的:分析miR-381-3p在宫颈癌组织中的表达情况,并探索其可能的靶基因及分子调控机制,为宫颈癌的防治提供思路。方法:本研究通过TCGA数据库了解miR-381-3p在宫颈癌与宫颈癌旁组织中的表达,采用miRWalk、miRDB和miRTarBase获取下游靶基因,并用DAVID对下游靶基因行GO功能注释及KEGG富集分析,再构建蛋白与蛋白相互作用网络并找出关键基因,最后验证关键基因的表达。结果:成熟的miR-381-3p在多个物种间的序列有高度保守性,TCGA数据库显示:相比癌旁组织,宫颈癌组织中的miR-381-3p表达下调。GO功能注释参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录进行正向调节的生物学过程、细胞核等细胞组分、蛋白质结合等分子功能。KEGG表明靶基因富集于癌症通路、乳腺癌、胃癌、Hippo、MAPK等信号通路。ESR1、LEF1、PBX1、CCND2、FGFR2、CADM1、TCF3、MPP6、PVRL1、UBE3A是miR-381-3p的关键基因,还发现ESR1、PBX1、CCND2在宫颈癌的表达水平低于正常组织。结论:miR-381-3p在宫颈癌中呈低表达,其可能作为抑癌基因对宫颈癌的生物学过程起一定的作用,有望成为宫颈癌诊治的新靶点。

lncRNA MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN介导慢性阻塞性肺疾病发展的分子机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MEG8通过调控miR-367-3p/磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)介导慢性阻塞性肺疾病(COPD)发展的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测16HBE细胞和COPD组织lncRNA MEG8表达水平;在香烟烟雾提取物(CSE)刺激后的16HBE细胞中过表达lncRNA MEG8及加入miR-367-3p inhibitor后同时敲减lncRNA MEG8或PTEN,采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测细胞凋亡、细胞增殖和炎症因子水平的变化;利用双荧光素酶报告系统对lncRNA MEG8、miR-367-3p、PTEN的靶向关系进行验证。结果 MEG8在CSE刺激的16HBE细胞和COPD临床组织样本中表达降低(P<0.05)。相比于CSE组,过表达MEG8后CSE刺激的16HBE细胞凋亡和炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平降低(P<0.05),促凋亡蛋白Bax、Caspase3和Cleaved-caspase3表达水平降低(P<0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验验证了MEG8可靶向抑制miR-367-3p(P<0.05),同时miR-367-3p可靶向抑制PTEN的表达(P<0.05),进而抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应(P<0.05)。在CSE刺激下,相较于Control组,加入miR-367-3p inhibitor可显著上调16HBE细胞中PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),增强细胞增殖活性(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase 3和Cleaved-caspase3的表达水平(P<0.05),上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05),抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05),随后敲降MEG8或PTEN可恢复PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),抑制细胞增殖活性(P<0.05),逆转miR-367-3p inhibitor导致的细胞凋亡(P<0.05)以及对凋亡相关蛋白的调控作用(P<0.05),增强炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN轴抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应,并可能为临床COPD的治疗提供新的治疗策略。

miR-181基因家族在临床常见疾病中的研究进展

微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA,广泛存在于真核生物体内,能够在转录后通过抑制目的基因信使RNA(mRNA)的翻译或促进mRNA降解来调节基因表达。miRNA已成为多种生物过程的关键调控因子,各种调控机制不仅控制着它们的表达,还控制着它们的活性和生物利用度,这取决于miRNA在人类相关蛋白质编码基因的潜在结合位点。miRNA在免疫系统的发育和调控中也发挥着重要的作用,可以调控机体关键的细胞过程,包括细胞分化、血管生成和炎症反应的发生。现已发现很多生理过程和病理结果高度依赖于miRNA,包括癌症、心血管疾病和代谢性疾病。其中,miR-181基因家族在胚胎发育、细胞增殖、凋亡、自噬、线粒体功能和免疫反应等关键生物过程中发挥调节作用。该文综述了近年来miR-181基因家族在临床疾病中的诊断和治疗方向及研究前沿,以期为miRNA的临床疾病治疗提供新的思路。