脑胶质瘤中miR-7与EGFR/PI3K信号通路相关基因蛋白表达的关系

目的观察脑胶质瘤组织、U251细胞中miR-7、EGFR/PI3K信号通路相关基因蛋白(EGFR、PI3K和AKT2)的表达关系。方法 42例脑胶质瘤患者,手术切除取肿瘤组织,其中8例选取癌旁正常脑组织。培养脑胶质瘤U251细胞,分为空白对照组(仅加入脂质体)、无义序列组(加入无义序列和脂质体)、miR-7转染组(转染miR-7基因片段)。采用RT-PCR法检测脑胶质瘤组织、各组U251细胞中的miR-7;免疫组化法检测胶质瘤组织中的EGFR、PI3K和AKT蛋白,RT-PCR和Western blotting法分别检测各组U251细胞EGFR、PI3K、AKT2 mRNA和蛋白。结果脑胶质瘤和正常脑组织中的miR-7 mRNA表达分别为1.47±0.27和3.47±0.15,两者比较,P<0.05。随着脑胶质瘤WHO级别的增加,miR-7表达逐渐减少,EGFR、PI3K和AKT2表达增加(P均<0.05)。脑胶质瘤组织中miR-7与EGFR、PI3K、pAKT表达呈负相关(r分别为-0.754、-0.528、-0.467,P均<0.05)。U251细胞转染miR-7后EGFR、PI3K和AKT表达降低(P均<0.05)。结论脑胶质瘤组织中miR-7表达减少,与EGFR/PI3K通路成员表达呈负相关;U251细胞转染miR-7后EGFR、PI3K和AKT表达降低。EGFR/PI3K通路可能是miR-7调控胶质瘤发生发展的重要机制之一。

microRNA-7敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响

目的:观察microRNA-7(miR-7)敲减对内毒素诱导小鼠急性肺损伤的影响并探讨其意义。方法:利用脂多糖(LPS)腹腔注射(10 mg/kg体重)野生型(Wild type,WT)小鼠和miR-7基因敲减(Knockdown,KD)小鼠建立急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)模型;HE染色观察肺组织病理学变化;计算肺泡灌洗液(BAL)中的细胞总数;Real-time PCR检测肺组织炎症相关因子表达变化;流式细胞术(FACS)进一步检测BAL中固有免疫细胞γδT细胞、F4/80巨噬细胞(Macrophages,Mφ)和适应性免疫细胞CD4^+T细胞和CD8^+T细胞的比例和绝对数变化;FACS检测CD4^+T细胞活化相关分子CD62L和CD69的表达水平。结果:相对野生型(Wild type,WT)小鼠,HE染色显示miR-7KD小鼠的肺组织小血管充血和炎性细胞浸润明显减少,病理性损伤明显减轻;Real-time PCR结果显示促炎性细胞因子IL-6的表达水平显著降低(P<0.01),而抗炎性细胞因子IL-4、TGF-β的表达水平明显增加(P<0.05);同时,BAL中总细胞数显著减少(P<0.05);FACS检测进一步显示miR-7KD小鼠的BAL中F4/80^+Mφ细胞的比例及绝对数均明显下调(P<0.05),而γδT细胞的比例上调(P<0.05),但其细胞绝对数无差异(P>0.05);BAL中CD4^+T细胞和CD8^+T细胞的比例及其绝对数均显著降低(P<0.05);最后CD4^+T细胞活化膜分子CD62L的表达水平明显上调(P<0.05),而CD69的表达水平显著下调(P<0.05)。结论:miR-7敲减可减轻ALI模型小鼠的肺部损伤,提示其可能在ALI发生中发挥了重要调控作用。

microRNA-7对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞组成的影响

目的:研究miR-7(MicroRNA-7,miRNA-7)对小鼠肠系膜淋巴结αβT淋巴细胞比例的影响并初步探讨其意义。方法:利用miR-7基因敲减(Knockdown,KD)小鼠模型,观察其肠系膜淋巴结大小、重量和淋巴结细胞总数,以及HE染色的病理学变化;流式细胞术(FACS)检测淋巴结中αβT淋巴细胞亚群(CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)以及CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化相关分子CD69、CD62L和功能相关因子IFN-γ表达的情况。结果:与野生型(Wild type,WT)小鼠相比,miR-7KD小鼠肠系膜淋巴结大小、重量指数和淋巴结细胞总数均显著增高(P<0.05),且HE染色显示MLNs有病理性改变;肠系膜淋巴结中αβCD3+T细胞比例增加显著,其中以CD4+T细胞比例变化最为明显(P<0.05),而CD19+B淋巴细胞比例明显下调(P<0.05),但各亚群细胞总数均明显增加(P<0.05);最后,CD4+T细胞和CD8+T细胞中的CD62L+细胞的比例均显著下调(P<0.05),而CD69+细胞和IFN-γ+细胞比例均显著上调(P<0.05)。结论:miR-7敲减后可显著影响肠系膜淋巴结中αβT淋巴细胞的组成比例,提示其对肠系膜淋巴结中淋巴细胞的组成和功能具有重要的调控作用。

METTL3介导的LncRNA MIR99AHG通过抑制miR-136-5p表达诱导卵巢颗粒细胞凋亡的机制研究

目的 研究LncRNA MIR99AHG(MIR99AHG)在化疗药物导致的卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及其潜在的调节机制。方法 采集正常女性和卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)患者的卵泡液,检测MIR99AHG表达。将卵巢颗粒细胞KGN分为对照组、顺铂组、顺铂+NC shRNA组、顺铂+sh-MIR99AHG组、顺铂+vector组、顺铂+OE-METTL3组、顺铂+OE-METTL3+OE-MIR99AHG组、顺铂+OE-MIR99AHG组、顺铂+NC mimic组、顺铂+miR-136-5p mimic组及顺铂+sh-MIR99AHG+NC inhibitor组和顺铂+sh-MIR99AHG+miR-136-5p inhibitor组。KGN细胞经相应载体或质粒处理后,采用RIP分析MIR99AHG的m6A修饰水平;在线数据库预测MIR99AHG与miR-136-5p的结合位点,并通过荧光素酶报告基因分析进行验证;采用CCK-8和流式细胞术分析KGN细胞的活力和凋亡水平;ELISA检测Caspase-3酶活性;Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2和Bax表达水平。结果 与正常女性相比,POF患者卵泡液中MIR99AHG表达水平显著上调(P<0.001)。与对照组相比,顺铂处理组KGN细胞中MIR99AHG表达显著上调,METTL3表达及蛋白水平显著下调(P<0.05)。与对照组相比,顺铂处理组KGN细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.05);而与NC shRNA组相比,sh-MIR99AHG组KGN细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。RIP分析发现,Anti-m6A抗体下拉复合物中MIR99AHG显著富集。与vector组相比,OE-METTL3组MIR99AHG的m6A水平显著升高,MIR99AHG mRNA表达水平显著降低(P<0.05);OE-METTL3组KGN细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05);共转染OE-MIR99AHG可逆转OE-METTL3对KGN细胞活力、凋亡及相关蛋白表达的影响。miR-136-5p与MIR99AHGA存在结合位点,MIR99AHGA负调控miR-136-5p表达。与NC-mimic组相比,miR-136-5p mimic组细胞活力及BCL-2蛋白表达明显升高,细胞凋亡率、Caspase-3酶活性及Bax蛋白表达明显降低(P<0.05)。共转染miR-136-5p inhibitor逆转了sh-MIR99AHG对细胞KGN细胞活力、凋亡及相关蛋白表达的影响(P<0.05)。结论 顺铂诱导MIR99AHG在卵巢颗粒细胞中上调,METTL3通过m6A甲基化修饰抑制MIR99AHG表达,促进MIR99AHG靶标miR-136-5p的上调,从而抑制卵巢颗粒细胞凋亡,改善化疗药物顺铂介导的卵巢早衰。