miR-93-5p通过PI3K/AKT通路调控HepG2细胞自噬

目的:探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖消耗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路的影响。方法:高浓度葡萄糖诱导构建胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,设计合成miR-93-5p inhibitor和NC,结合自噬抑制剂3-MA,将细胞分为Control组、IR组、IR+inhibitor NC组、IR+inhibitor组、IR+3-MA+inhibitor组。CCK8法检测各组细胞增殖活力,试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞糖原合成情况,Western-Blot法检测细胞自噬基因微管相关蛋白1轻链3(autophagy genes microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-I、LC3-II、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)蛋白、PI3K/AKT通路蛋白(AKT、p-AKT)的表达。结果:与对照组相比,IR组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达下降(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均增加(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比,IR+inhibitor组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达增加(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均下降(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比,3-MA能逆转miR-93-5p inhibitor的作用。结论:miR-93-5p通过PI3K/AKT通路促进HepG2细胞自噬,进而抑制胰岛素抵抗,缓解糖尿病造成的机体损伤。

miR-210-5p对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响及作用机制分析

[目的]观察miR-210-5p在小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化中的作用并探讨其作用机制.[方法]将小鼠脂肪干细胞分空白对照组、miR-210-5p模拟物阴性对照组、miR-210-5p模拟物组、miR-210-5p抑制物阴性对照组和miR-210-5p抑制物组,采用CCK-8细胞计数法检测细胞增殖能力,茜素红染色观察钙盐矿化结节形成能力,用实时荧光定量PCR检测miR-210-5p水平及成骨分化标志物BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA表达水平,进而用蛋白免疫印迹法检测BMP2、Smad1、Smad5和Runx2蛋白表达水平.[结果] miR-210-5p模拟物组细胞增殖活力显著升高(P<0.01),矿化结节显著增加,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01);miR-210-5p抑制物组细胞增殖活力显著降低(P<0.01),矿化结节显著降低,BMP2、Smad1、Smad5和Runx2 mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.01).[结论] miR-210-5p可能通过调控BMP2/Smad信号通路促进小鼠脂肪干细胞增殖和成骨分化.

LncRNA FGD5-AS1调节miR-93-5p/BMP2轴促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)FGD5-AS1调节微小RNA miR-93-5p/骨形态发生蛋白-2(BMP2)轴对人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)成骨分化的影响。方法取对数增殖期的hBM-MSCs,分别检测成骨分化前、后lncRNA FGD5-AS1、miR-93-5p、BMP2 mRNA表达水平;将细胞分别转染或共转染pcDNA FGD5-AS1、miR-93-5p inhibitor、miR-93-5p mimics及相应阴性对照,分组为pcDNA NC组、pcDNA FGD5-AS1组、inhibitor NC组、miR-93-5p inhibitor组、pcDNA FGD5-AS1+mimics NC组、pcDNA FGD5-AS1+miR-93-5p mimics组,取未转染细胞作为空白组;CCK-8法检测细胞增殖;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测其活性;茜素红染色鉴定细胞矿化结节形成;Western blot检测BMP2及成骨相关标志物--骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、成骨相关转录因子(OSX)水平;双荧光素酶报告基因实验分别验证miR-93-5p与FGD5-AS1、BMP2的靶向关系。结果miR-93-5p分别与FGD5-AS1、BMP2存在靶向关系。与分化前相比,hBM-MSCs成骨分化后lncRNA FGD5-AS1、BMP2 mRNA表达显著增加,miR-93-5p表达显著下降(P<0.05);与pcDNA NC组相比,pcDNA FGD5-AS1组FGD5-AS1表达显著增加(P<0.05),表明转染成功。后续实验发现矿化结节产生、细胞增殖、ALP活性及BMP2、OCN、OPN、OSX表达均显著增加(P<0.05);与inhibitor NC组相比,miR-93-5p inhibitor组miR-93-5p表达降低,表明转染成功。后续实验发现矿化结节产生、细胞增殖、ALP活性及BMP2、OCN、OPN、OSX表达均显著增加(P<0.05);miR-93-5p过表达可抑制FGD5-AS1对细胞成骨分化的促进作用(P<0.05)。结论上调FGD5-AS1可以促进细胞成骨分化,可能与miR-93-5p/BMP2轴有关。

呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患儿外周血miR-93-5p表达与Th1/Th2平衡的关系

目的 呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)下呼吸道感染患儿外周血微小RNA-93-5p表达与辅助型T细胞1/2(Th1/Th2)平衡的关系。方法 选取儿科建档就诊的RSV下呼吸道感染患儿58例为RSV组,同时选取年龄性别匹配的健康儿童60例为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测血清miR-93-5p水平;流式细胞仪计数Th1、Th2百分率,计算Th1/Th2表达,酶联免疫吸附法检测白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-4、IL-10及干扰素γ(interferon γ,IFN-γ)水平,Spearman分析miR-93-5p与Th1/Th2的关系;Logistics回归分析影响RSV下呼吸道感染发生的危险因素。结果 RSV组miR-93-5p水平高于对照组(P<0.05);RSV组Th1、Th1/Th2低于对照组(P<0.05),RSV组Th2高于对照组;RSV组IL-2、IFN-γ水平低于对照组(P<0.05);RSV组IL-4、IL-10水平高于对照组(P<0.05);RSV组miR-93-5p与IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈负相关性(P<0.05);与IL-4、IL-10呈正相关性(P<0.05);Logistics回归分析显示高水平miR-93-5p与低水平的Th1/Th2是影响RSV下呼吸道感染的危险因素(P<0.05)。结论 RSV下呼吸道感染患儿外周血miR-93-5p呈高表达,其高表达可能与Th1/Th2平衡密切相关。

miR-93-5p 靶向CCNG2基因对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:研究miR-93-5p对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法:运用qRT-PCR、Western blot检测甲状腺癌细胞SW579、人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中miR-93-5p、CCNG2的表达;将anti-miR-93-5p组(转染anti-miR-93-5p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-CCNG2组(转染pcDNA-CCNG2)、anti-miR-93-5p+si-con组(共转染anti-miR-93-5p和si-con)、anti-miR-93-5p+si-CCNG2组(共转染anti-miR-93-5p和si-CCNG2),均用脂质体法转染至SW579细胞;MTT法检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果:与人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1相比,甲状腺癌细胞SW579中miR-93-5p表达显著升高,CCNG2表达显著降低(P<0.05);抑制miR-93-5p、过表达CCNG2均可抑制SW579细胞增殖,促进凋亡;miR-93-5p可直接抑制SW579细胞中CCNG2的表达,敲减CCNG2可逆转抑制miR-93-5p对SW579细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论:抑制miR-93-5p可抑制甲状腺癌细胞的增殖,促进凋亡,其机制可能与靶向负调控CCNG2有关,将可为分化型甲状腺癌的预防和治疗提供新靶点。

miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究

目的探讨mi R-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCs C3H10T1/2细胞的成骨分化。方法构建Smad5 3’-UTR-荧光素酶报告载体(pmi R-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察mi R-93-5p对Smad5 3’-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为mi R-93-5p的靶基因。将mi R-93-5p mimics(M组)与mi R-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组mi R-93-5p mimics阴性对照(MC组)与mi R-93-5p inhibitor阴性对照(In C组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)及Western blot检测各组细胞Smad5在m RNA及蛋白水平的相对表达量;14 d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解mi R-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应。结果双荧光素酶报告基因检测结果显示,mi R-93-5p能与Smad5 m RNA3’-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。q RT-PCR检测示,M组及In组Smad5的m RNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及In C组比较差异均无统计学意义(P>0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较In C组表达量上调。茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较In C组钙盐沉积明显增多。结论Smad5是mi R-93-5p的靶基因,mi R-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化。

基于网络药理学探究愈髋饮防治创伤性股骨头坏死作用机制

目的:网络药理学方法预测愈髋饮防治创伤性股骨头坏死(ONFH)的作用机制并体外实验验证。方法:利用TCMSP数据库筛选愈髋饮成分及靶点,股骨头坏死为关键词使用DisGeNET、OMIM、GeneCards数据库筛选疾病靶点,并筛选潜在治疗靶点,以此靶点构建PPI网络得到核心治疗靶点后进行GO与KEGG富集分析并进行分子对接。依据网络药理学结果进行体外实验,体外实验采用BMSC细胞。结果:愈髋饮主要有效成分木犀草素、槲皮素,筛选出5个核心靶点BMP2、VEGFA、MAPK1、PTGS1、PTGS2。核心靶点的富集分析得出TGF-β信号通路参与愈髋饮治疗ONFH的过程。体外验证结果提示愈髋饮可调低miR-93-5p的转录水平并促进TGF-β通路及成骨分化相关蛋白的表达。结论:愈髋饮可通过调低miR-93-5p调控TGF-β相关通路促进BMSC成骨分化而防治创伤性ONFH。