miR-2467、miR-96-5p在妊娠期糖尿病中的临床意义

目的:探讨微小核糖核酸-2467(miR-2467)、miR-96-5p在妊娠期糖尿病(GDM)中的临床意义。方法:纳入108例GDM住院患者作为GDM组,另选取同期产检的糖耐量正常孕妇82例为对照组。比较2组血清miR-2467、miR-96-5p相对表达量以及空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2hFBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),分析miR-2467、miR-96-5p与上述血糖指标的相关性。采用Logistic多元回归模型分析GDM发生的危险因素,绘制受试者工作特征曲线,分析miR-2467、miR-96-5p评估GDM的曲线下面积(AUC)。结果:GDM组血清miR-2467表达、FBG、2hPG、HbA1c水平及HOMA-IR高于对照组,miR-96-5p表达低于对照组(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示血清miR-2467表达与FBG、2hPG、HbA1c、HOMA-IR呈正相关,血清miR-96-5p表达与上述4项指标呈负相关(P均<0.05)。Logistic多元回归分析示孕早期BMI增长≥1.73kg/m^(2)、孕中期BMI增长≥4.88kg/m^(2)、糖尿病家族史、miR-2467≥3.44是GDM发生的危险因素,miR-96-5p≥1.95是GDM发生的保护因素(P<0.05)。血清miR-2467联合miR-96-5p评估GDM的AUC为0.865,敏感度、特异度分别为91.50%、81.50%。结论:miR-2467、miR-96-5p与GDM患者血糖指标及HOMA-IR存在相关性,对评估GDM具有一定意义。

非酒精性脂肪性肝病患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平变化及其临床意义探讨

目的 探讨非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平变化及其临床意义。方法 2019年11月~2022年1月我院诊治的NAFLD患者62例和同期性别和年龄相匹配且无过量饮酒史的健康体检者80例,采用实时荧光定量RT-PCR法检测血清miR-183-5p和miR-96-5p水平,应用多因素Logistic回归分析NAFLD发生的危险因素,应用受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)评估指标诊断严重脂肪性肝病的效能。结果 NAFLD患者BMI、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、空腹血糖(FPG)和血脂水平显著高于健康人(P<0.05),血清miR-183-5p和miR-96-5p水平分别为(0.8±0.2)和(1.2±0.3),显著低于健康人【分别为(1.4±0.4)和(2.3±0.6),P<0.05】;17例重度NAFLD患者血清miR-183-5p和miR-96-5p水平分别为(0.4±0.1)和(0.8±0.2),显著低于21例中度患者【分别为(0.8±0.2)和(1.2±0.3),P<0.05】或24例轻度患者【分别为(1.1±0.3)和(1.5±0.4),P<0.05】;经Logistic回归分析结果显示,BMI、HOMA-IR、FPG、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇以及血清miR-183-5p和miR-96-5p低水平是NAFLD发生的独立危险因素(P<0.05);应用血清miR-183-5p和miR-96-5p联合检测评估重度NAFLD发生的AUC为0.821,显著高于两项指标单独评估的0.713或0.718(P<0.05),其准确度、灵敏度和特异度分别达到77.4%、76.5%和77.8%。结论NAFLD患者血清miR-183-5p和miR-96-5p呈低水平,其水平越低,可能预示着肝内脂肪变程度越重,即它们的血清水平可在一定程度上反映疾病的严重程度,可作为诊断和评估病情的分子标志物,值得进一步研究。

新生儿脓毒血症血清miR-16-5p、miR-96-5p水平与疾病严重程度和机体炎性反应的相关性研究

目的探讨血清微小RNA-16-5p(miR-16-5p)和微小RNA-96-5p(miR-96-5p)水平与新生儿脓毒血症(NS)疾病严重程度和机体炎性反应的相关性。方法选择2020年3月—2022年3月海南现代妇女儿童医院收治的52例NS患儿作为脓毒血症组,同时选择同期住院的52例非脓毒血症患儿作为对照组。定量检测两组血清miR-16-5p、miR-96-5p、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)和白介素6(IL-6)含量,收集两组基线资料与入院24 h内临床检查结果。采用双变量Pearson相关性检验分析血清miR-16-5p、miR-96-5p水平与疾病严重程度和炎性反应指标的相关性。结果脓毒血症组格拉斯哥昏迷评分(GCS)、急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)、序贯器官衰竭估计评分(SOFA)、白细胞计数(WBC)、血肌酐、PCT、CRP和IL-6水平显著高于对照组,而血清白蛋白水平显著低于对照组(均P<0.05)。脓毒血症组血清miR-16-5p表达水平显著高于对照组,而miR-96-5p表达水平显著低于对照组(均P<0.05)。miR-16-5p高表达者的GCS评分、APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平均显著高于miR-16-5p低表达者(均P<0.05)。miR-96-5p高表达者的APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平均显著低于miR-96-5p低表达者(均P<0.05)。脓毒血症组血清miR-16-5p水平与GCS评分、APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平呈正相关(均P<0.05),而血清miR-96-5p水平与APACHEⅡ评分、SOFA评分、WBC、PCT、CRP和IL-6水平呈负相关(均P<0.05)。结论NS患儿血清miR-16-5p水平升高,miR-96-5p水平降低,与疾病严重程度和机体炎性反应相关,提示miR-16-5p和miR-96-5p可作为NS早期诊断和病情评估的标志物。

高糖环境下miR-96-5p对人角质形成细胞的影响及相关机制研究

目的探讨高糖环境下miR-96-5p对人角质形成细胞的影响及相关机制。方法分离人角质形成细胞以50 mmol/L葡萄糖终浓度模拟高糖环境。通过转染miR-96-5p模拟物和抑制剂构建miR-96-5p过表达和抑制组,分为空白组、正常培养组、高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组、高糖培养+miR-96-5p inhibitor组。采用划痕实验观察细胞迁移水平,采用CCK-8实验观察细胞增殖水平,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。采用Western blot检测BNIP3、FAK、FAK磷酸化蛋白(p-F AK)蛋白的表达水平。结果50 mmol/L高糖处理后角质细胞折光性降低,同时细胞中出现空洞。与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞迁移量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞迁移量明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞增殖量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞增殖明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点细胞侵袭量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组细胞侵袭明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05);与空白组和正常培养组比较,高糖培养组、高糖培养+miR-96-5p minic组和高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的各时间点BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表达量明显更低(P<0.05),且高糖培养+miR-96-5p inhibitor组的BNIP3、FAK、p-F AK蛋白表达量明显高于高糖培养组和高糖培养+miR-96-5p minic组(P<0.05)。结论miR-96-5p可通过靶向调控BNIP3/FAK信号通路的表达从而影响角质细胞的增殖、侵袭和迁移能力,进而发挥影响糖尿病足创面愈合的作用。

miR-96-5p靶向PTEN激活PI3K-Akt信号通路抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭实验研究

目的:探讨miR-96-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、侵袭和增殖的作用及分子机制。方法:在人NSCLC细胞系A549中转染miR-96-5p类似物(miR-96-5p mimics)、阴性对照(NC mimics)或miR-96-5p抑制剂(miR-96-5p inhibitor)、阴性对照(NC inhibitor),通过CCK-8法检测细胞的增殖能力,通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的迁移侵袭能力;采用荧光素酶报告基因实验检测miR-96-5p与磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)启动子区DNA的结合;采用蛋白质免疫印迹实验检测miR-96-5p对PTEN/PI3K/Akt信号通路的调控作用。结果:抑制miR-96-5p, NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖能力降低,过表达miR-96-5p促进NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖(均P<0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-96-5p能与PTEN启动子区DNA结合;蛋白质免疫印迹实验结果表明,抑制miR-96-5p, PTEN表达升高、p-Akt的表达降低,过表达miR-96-5p后,PTEN表达降低、p-Akt的表达升高(均P<0.05),且沉默PTEN的表达后,逆转了敲低miR-96-5p对p-Akt的抑制作用(均P<0.05)。结论:miR-96-5p通过抑制PTEN,激活PI3K-Akt信号通路,促进NSCLC细胞的迁移、侵袭和增殖。

大黄素通过miR-96-5p靶向叉头蛋白K2减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞的损伤

目的:探讨大黄素通过miR-96-5p靶向叉头蛋白K2(FOXK2)减轻狼疮性肾炎肾小球系膜细胞(MCs)损伤。方法:检测MRL/faslpr小鼠(狼疮性肾炎肾组)和MRL/MPJ小鼠(对照组)24 h尿蛋白以及血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)含量。MCs分离纯化后分为:MCs组(未做任何处理的MCs);L-EMO组(10μmol/L大黄素处理MCs)、M-EMO组(25μmol/L大黄素处理MCs)、H-EMO组(50μmol/L大黄素处理MCs)、H-EMO+miR-96-5p-NC组(50μmol/L大黄素处理MCs后转染miR-96-5p-NC)、HEMO+miR-96-5p-minic组(50μmol/L大黄素处理MCs后转染miR-96-5p-minic)。双荧光素酶报告基因实验验证miR-96-5p和FOXK2的靶向关系;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-96-5p表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测FOXK2以及凋亡相关蛋白表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测MCs炎性因子水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定MCs活力;Annexin-V FITC/PI双染法检测MCs凋亡情况。结果:与对照组相比,狼疮性肾炎组24 h尿蛋白含量、血清BUN和Scr水平显著升高(P<0.05);与MCs组相比,L-EMO组、MEMO组、H-EMO组miR-96-5p的表达量、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、A450值、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白水平依次显著下降(P<0.05),FOXK2水平、细胞凋亡率、Bcl-2相关的X基因(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved-Caspase-3)蛋白水平依次显著升高(P<0.05),大黄素作用效果呈现剂量依赖性;与H-EMO组、H-EMO+miR-96-5p-NC组相比,H-EMO+miR-96-5p-minic组显著升高miR-96-5p的表达量、炎性因子水平、A450值以及Bcl-2蛋白水平(P<0.05),显著降低FOXK2水平以及细胞凋亡率(P<0.05)。结论:大黄素通过下调miR-96-5p进而上调FOXK2,从而减轻狼疮性肾炎MCs损伤。

miR-96-5p通过下调肌动蛋白结合蛋白1促进卵巢癌干细胞顺铂耐药性

目的 探索微小核糖核酸(miRNA)miR-96-5p通过调控肌动蛋白结合蛋白1(profilin 1,PFN1)对卵巢癌干细胞(SiHa细胞)顺铂耐药的分子机制。方法 采用RT-qPCR检测miR-96-5p表达水平;将SiHa细胞置于不同浓度顺铂的培养基中,构建顺铂耐药细胞SiHa/DDP;采用Western blot检测蛋白的表达水平;双荧光素酶报告实验验证miR-96-5p与PFN1的靶向关系;MTT、Transwell和流式细胞术检测细胞增殖、侵袭和凋亡;成球实验检测细胞的成球能力。结果 miR-96-5p在SiHa细胞中高表达,且在SiHa/DDP细胞中的表达最高;敲降miR-96-5p可抑制SiHa/DDP细胞增殖、侵袭和干细胞成球能力并促进细胞凋亡;PFN1是miR-96-5p的潜在靶基因,过表达miR-96-5p通过下调PFN1促进SiHa/DDP细胞增殖、侵袭和干细胞成球,抑制细胞凋亡。结论 miR-96-5p通过靶向调控PFN1,促进SiHa/DDP细胞增殖、侵袭及其干细胞成球并抑制凋亡,从而增强SiHa/DDP细胞对顺铂的耐药性。

猪miR-96-5p组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期感染C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)攻毒组及对照组仔猪回肠组织高通量测序结果的基础上,为研究猪miR-96-5p在不同组织中的表达,分析其关键靶基因在仔猪感染C型产气荚膜梭菌导致腹泻过程中的调控作用.【方法】采用RT-qPCR方法检测miR-96-5p在仔猪各组织的表达量,构建组织表达谱,并检测对照组(IC)、易感组(IS)和耐受组(IR)回肠组织中miR-96-5p及其靶基因的表达量;利用生物信息学软件对miR-96-5p进行保守性分析、靶基因预测、GO功能和KEGG信号通路富集分析.【结果】miR-96-5p成熟体序列在不同物种间高度保守;预测到靶基因179个;预测获得与免疫炎症反应相关的信号通路有ErbB和MAPK;筛选到与仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染相关的靶基因有FOXO1、MAP2K1;RT-qPCR结果显示,miR-96-5p在回肠组织中高表达,且其在IC、IS、IR组回肠组织中的表达量与高通量测序结果趋势一致,其靶基因FOXO1、MAP2K1在IR和IS组的表达量均极显著低于IC组(P<0.01),IS组极显著低于IR组(P<0.01).【结论】miR-96-5p可能靶向调控FOXO1、MAP2K1参与仔猪感染C型产气荚膜梭菌性腹泻的过程.

MiR-96-5p靶向调控MTSS1表达对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨miR-96-5p对人结肠癌细胞生物学行为的影响及其作用机制。方法应用miRNA转染技术,将miR-96-5p抑制物(miR-96-5p inhibitor)及microRNA无关序列(miR-NC)转染入结肠癌HCT116细胞中;采用免疫荧光及RT-PCR验证转染效率后,分别利用MTT、划痕实验、Transwell、凋亡实验检测miR-96-5p对结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力的影响;采用裸鼠皮下成瘤实验检测miR-96-5p对人结肠癌细胞成瘤能力的影响;miRNA靶基因预测软件分析miR-96-5p潜在靶目标并利用双荧光素酶报告基因和Western blot实验进行验证。结果免疫荧光及RT-PCR结果提示miR-96-5p inhibitor显著下调miR-96-5p在HCT116细胞中的表达。MTT、划痕实验、Transwell及凋亡实验结果提示下调miR-96-5p表达显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力并且促进细胞发生凋亡。裸鼠皮下成瘤实验提示过表达miR-96-5p能够促进结肠癌细胞成瘤能力,下调miR-96-5p的表达能够明显削弱其成瘤能力。miRNA靶基因预测软件分析提示MTSS1可能为miR-96-5p目标靶基因;双荧光素酶报告基因验证了miR-96-5p对MTSSI的靶向调控,且Western blot实验结果提示下调miR-96-5p可明显促进MTSS1蛋白在结肠癌细胞中的表达。结论下调miR-96-5p的表达可抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力并促进细胞发生凋亡,这种作用可能通过对MTSS1的靶向调控来实现。

miR-96-5p在肝细胞癌根治术后早期复发患者中的表达及其临床意义

目的:探讨miR-96-5p在肝细胞癌根治术后复发患者中的表达及其临床意义。方法:从我院肝癌标本库中选取61例冻存的原发性肝细胞癌组织标本,根据筛选标准将其中33例归为早期复发组(根治术后1年内出现肝内复发病灶),28例为非早期复发组(术后超过2年未出现肝内复发病灶);运用实时荧光定量PCR验证miR-96-5p在两组肝细胞癌组织的表达水平。结果:miR-96-5p在早期复发组肝癌组织中表达明显下调[(0.634±0.783)vs.(5.182±11.321),P=0.043],其在肝癌组织中的表达与肝癌术后早期复发及肿瘤直径、脉管癌栓有关(P<0.05)。结论:miR-96-5p与肝癌根治术后早期复发密切相关,并极有可能成为肝癌早期复发的分子标记物,以及为未来肝癌靶向治疗提供有效的靶点。

miR-96-5p靶向叉头状转录因子O1对Ishikawa细胞的作用

【目的】探讨微小RNA(miR)-96-5p通过靶向叉头状转录因子O1(FOXO1)基因对子宫内膜癌细胞增殖和侵袭的影响。【方法】qRT-PCR检测正常组织和子宫内膜癌组织中miR-96-5p和FOXO1 mRNA的表达,West⁃ern blot法检测FOXO1蛋白表达。分析miR-96-5p及FOXO1表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系。转染pcD⁃NA、pcDNA-FOXO1、inhibitor NC、miR-96-5p inhibitor、miR-96-5p mimic、miR-96-5p+FOXO1到子宫内膜癌Ishi⁃kawa细胞,分别记为pcDNA组、FOXO1组、inhibitor NC组、miR-96-5p inhibitor组、miR-96-5p组、miR-96-5p+FOXO1组,对照组不进行转染。取稳定转染的各组细胞,CCK-8和Transwell小室检测细胞活力和侵袭能力,West⁃ern blot检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、活化多聚ADP核糖聚合酶(cleaved PARP)、p21及波形蛋白的表达水平。TargetScan网站预测miR-96-5p与FOXO1的靶向关系,双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。Ishikawa细胞分为mimic NC组、miR-96-5p组、inhibitor NC组、miR-96-5p inhibitor组,qRT-PCR检测各转染组miR-96-5p和FOXO1 mRNA的表达,Western blot法检测FOXO1蛋白表达。【结果】子宫内膜癌组织中miR-96-5p的相对表达量较正常组织上调,相反,FOXO1 mRNA和蛋白相对表达量下调(P<0.01)。子宫内膜癌患者中miR-96-5p高表达与病理分级和临床分期呈正相关(P=0.034,P=0.010),与年龄和是否绝经无明显相关性(P=0.370,P=0.166);FOXO1低表达与病理分级和临床分期呈负相关(P=0.023,P=0.007),与年龄和是否绝经无明显相关性(P=0.344,P=0.144)。过表达FOXO1或抑制miR-96-5p表达后,Ishikawa细胞活力明显降低(P<0.05)、侵袭细胞数减少(P<0.01),cyclin D1、Vimentin蛋白表达水平明显降低,而cleaved PARP、p21蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与对照组比较,miR-96-5p组Ishikawa细胞活力明显升高(P<0.05)、侵袭细胞数增加(P<0.01),Cyclin D1、Vimentin蛋白表达水平明显升高,而cleaved PARP、p21蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与miR-96-5p组比较,过表达FOXO1可明显逆转miR-96-5p对Ishikawa细胞活力和侵袭的促进作用(P<0.05)。miR-96-5p靶向并负调控FOXO1的表达(P<0.05)。【结论】miR-96-5p可通过靶向负调控FOXO1促进子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭。

miR-96-5p靶向FOXO4对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨微小RNA-96-5p(miR-96-5p)对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:体外培养SD大鼠视网膜血管内皮细胞(RRVEC)进行实验,将细胞分为对照组(NG)、高糖组(HG),收集高糖诱导的细胞,分别或共同转染miR-96-5p模拟物(mimic)、无义miRNA(miR-NC)、FOXO4 siRNA(si-FOXO4)、FOXO4阴性对照序列(si-NC)、pcDNA-FOXO4、pcDNA。分别采用qRT-PCR与Western blotting检测miR-96-5p与FOXO4的表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证miR-96-5p的靶基因;Western blotting检测细胞中CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspased-3蛋白表达。结果:高糖处理后,RRVEC中miR-96-5p、CyclinD1、Bcl-2表达水平均显著降低,而FOXO4、p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表达水平显著升高,抑制细胞增殖活性,促进细胞凋亡;miR-96-5p过表达与抑制FOXO4表达后CyclinD1、Bcl-2表达水平显著升高,抑制p21、p27、Bax、cleaved-caspased-3表达,增强细胞增殖能力,抑制细胞凋亡;双荧光素酶报告实验证明,FOXO4是miR-96-5p的靶基因;FOXO4过表达可逆转miR-96-5p过表达对高糖诱导的RRVEC增殖和凋亡的作用。结论:miR-96-5p通过靶向FOXO4以抑制高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡并促进细胞增殖。

miR-96-5p靶向FOXO1调节成骨细胞衰老的作用

目的探讨miR-96-5p靶向FOXO1调节成骨细胞衰老的作用及其机制。方法20只6~8周昆明种小鼠随机分为青年对照组、衰老模型组,每组10只。采用D-半乳糖法建立小鼠衰老模型和成骨细胞衰老模型,通过μCT扫描分析小鼠胫骨组织,β-半乳糖苷酶衰老检测细胞衰老情况,Hoechst33258染色检测成骨细胞凋亡;qRT-PCR检测miR-96-5p的表达、骨形态发生蛋白2(BMP2)、碱性磷酸酶(ALP)mRNA及靶基因FOXO1mRNA的表达。结果μCT扫描分析结果显示衰老组小鼠胫骨骨组织在骨体积(BV/TV)、骨小梁密度(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨密度(BMD)上明显低于对照组(P<0.01),衰老成骨细胞β-半乳糖苷酶衰老染色细胞数量显著增多(P<0.01),而且衰老骨组织及成骨细胞中miR-96-5p表达水平显著低于对照组(P<0.01)。抑制miR-96-5p后β-半乳糖苷酶衰老染色细胞数量及凋亡阳性细胞数量显著增多(P<0.01),BMP2、ALPmRNA的表达量显著降低(P<0.01),FOXO1 mRNA显著升高(P<0.01)。结论miR-96-5p可能通过负调控FOXO1调节成骨细胞的衰老、凋亡和成骨分化,从而影响成骨细胞的衰老过程。

头颈鳞癌患者血清外泌体miR-96-5p高表达抑制FoxO1的生物学意义

目的:通过证实头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者血清外泌体(Exos)中miR-96-5p对叉头框转录因子O亚族1(FoxO1)的靶向调节作用,探讨Exo-miR-96-5p对HNSCC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为的影响及分子机制。方法:取2020年9月至2022年1月我院收治的HNSCC患者(25例)及同期体检健康者(40例)血清标本,超速离心法提取Exos,RT-PCR检测Exos中miR-96-5p表达;PKH67染液标记Exos后,与HNSCC细胞系-AGZY-973共培养,观察HNSCC细胞对Exos摄取的影响。AGZY-973细胞分为:Control组(加入DMEM培养基正常培养)、HNSCC患者血清Exos组(加入DMEM培养基和50μL HNSCC患者血清Exos悬液共培养)、健康对照者血清Exos组(加入DMEM培养基和50μL健康对照者血清Exos悬液共培养),CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测凋亡率;Transwell检测迁移、侵袭;RT-PCR法检测miR-96-5p表达;Western blot法检测细胞FoxO1及促凋亡蛋白Bax、死亡调解子(Bim)、凋亡蛋白p21表达。双荧光素酶报告试验验证miR-96-5p与FoxO1靶向关系;36只裸鼠分为Control组、Exos组、Exos-miR-96-5p inhibitor组、Exos-inhibitor-NC组、Exos-pcDNA FoxO1组、Exos-pcDNA NC组,每组6只。Control组接种AGZY-973细胞培养液,其余各组分别接种含50μL HNSCC患者血清Exos悬液、Exos-miR-96-5p inhibitor悬液、Exos-inhibitor-NC悬液、Exos-pcDNA-FoxO1悬液、Exos-pcDNA-NC悬液的AGZY-973细胞培养液,28d后,检测瘤体体积及瘤体重量,以验证HNSCC患者血清Exos对miR-96-5p及FoxO1调控的影响。结果:HNSCC患者血清Exos及健康对照者血清Exos均有完整膜,形态呈杯口状,均可被AGZY-973细胞摄取。HNSCC患者血清Exos中miR-96-5p表达高于健康对照者血清Exos(P<0.05)。与Control组相比,HNSCC患者血清Exos组AGZY-973细胞miR-96-5p表达升高,FoxO1及Bax、Bim、p21等凋亡蛋白表达降低,细胞增殖、迁移及侵袭能力升高,凋亡率降低(P<0.05);健康对照者血清Exos对AGZY-973细胞miR-96-5p/FoxO1轴及生物学行为影响不大(P>0.05)。miR-96-5p与FoxO1之间有靶向调控关系。HNSCC患者血清Exos中转染miR-96-5p inhibitor或pcDNA-FoxO1,均可部分逆转Exos发挥的促瘤体生长作用(P<0.05)。结论:HNSCC患者血清Exos可通过传递miR-96-5p,靶向下调FoxO1,发挥促进HNSCC细胞增殖、侵袭、迁移、生长等恶性生物学行为的发展。

miR-96-5p调控FOXO4表达影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡

目的探讨微小RNA-96-5p(miR-96-5p)调控叉头样转录因子O4(FOXO4)表达影响人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的分子机制。方法取瘢痕疙瘩组织30例与正常皮肤组织15例,原代培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常成纤维细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western Blot)分别检测细胞中miR-96-5p、FOXO4的表达水平。采用脂质体转染法分别将anti-miR-96-5p、anti-miR-NC、pcDNA-FOXO4、pcDNA-NC、anti-miR-96-5p与si-NC、anti-miR-96-5p与si-FOXO4转染至瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过qRT-PCR与Western Blot法验证转染效果。甲基噻唑基四唑(MTT)检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告实验验证miR-96-5p与FOXO4的靶向关系;Western Blot检测细胞周期蛋白1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(C-caspase-3)表达量。结果miR-96-5p在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达水平高于正常成纤维细胞(P<0.05),FOXO4的表达水平低于正常成纤维细胞(P<0.05);抑制miR-96-5p表达与FOXO4过表达后,与阴性转染组相比,细胞存活率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),C-caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05);荧光素酶报告实验证实miR-96-5p能够抑制FOXO4的3’-UTR区荧光素酶活性;抑制FOXO4表达可部分逆转抑制miR-96-5p表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及凋亡的影响。结论抑制miR-96-5p表达可能通过上调FOXO4的表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡。

血小板miR-96-5p在血小板储存过程中抗凋亡机制的研究

目的研究血小板微RNA(micro RNA)基因mi R-96-5p在血小板储存过程中抗凋亡的机制,探讨血小板储存时间的影响因素。方法用定量PCR方法检测储存起始和储存至第5天的健康血液捐献者的单采血小板中的24种与凋亡相关的mi RNAs的表达水平的变化,检测结果进行统计学分析,判断mi RNA在调节血小板存活或者凋亡方面的作用。结果与储存起始比较,血小板储存至第5天mi R-96-5p、mi R-16-5p、mi R-155-5p、mi R-148a-5p和mi R-296-5p的表达显著上升(P<0.01),而mi R-7-5p、mi R-145-5p、mi R-15a-5p、mi R-25-3p以及mi R-24-3p的表达显著下降(P<0.01)。转染mi R-96-5p抑制物至血小板72 h后,增加了细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的活性,抑制了Bcl-2和Bcl-xl的表达,促进了Bax的积累和活性caspase-3的加工。结论 mi R-96-5p在血小板储存中可能发挥抗凋亡作用。

hsa_circ_0102049通过miR-96-5p/AK3轴促进结直肠癌细胞EMT介导的增殖和转移

目的探讨环状RNA(circRNA)hsa_circ_0102049调控结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞增殖和转移能力的机制。方法从GEO数据库下载GSE126094数据集并通过R软件筛选差异表达的circRNA,构建hsa_circ_0102049的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)以敲低hsa_circ_0102049的表达量并通过RT-qPCR、CCK-8、Transwell和Western blot法等检测转染后CRC细胞的增殖和转移能力变化并探寻相关机制。结果在GSE126094数据集中,hsa_circ_0102049在癌组织中表达量显著高于癌旁组织(P<0.001)。在HCT116和DLD-1细胞中干扰hsa_circ_0102049后,细胞的增殖和迁移侵袭能力减弱(P<0.05),Western blot法检测结果显示,E-cadherin的表达量升高而N-cadherin和Vimentin的表达量降低(P<0.05)。为了探寻hsa_circ_0102049的作用机制,数据库分析筛选出可以与hsa_circ_0102049结合的小RNA(microRNA,miRNA)miR-96-5p以及miR-96-5p的下游靶标AK3,并且敲低hsa_circ_0102049引起miR-96-5p的升高和AK3的降低(P<0.05)。结论在CRC细胞中,高表达的hsa_circ_0102049通过miR-96-5p/AK3轴促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)从而增强细胞的增殖和转移。

miR-96-5p靶向HOXA9促进乳腺癌细胞增殖侵袭的机制研究

目的探究miR-96-5p靶向同源盒基因A9(HOXA9)促进乳腺癌细胞增殖侵袭的机制。方法收集2022年9—12月经手术切除的60例乳腺癌、癌旁组织样本及患者完整临床资料,miRNA微阵列分析2对乳腺癌与癌旁组织中差异表达的miRNA。qRT-PCR检测乳腺癌、癌旁组织及乳腺癌细胞系miR-96-5p表达水平,分析miR-96-5p表达与临床病理特征的关系。通过MTT、克隆形成、EdU法、划痕、Transwell实验与体内异种移植实验检测miR-96-5p对乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7的影响,分析预测miR-96-5p与HOXA9的靶向作用关系。WB检测乳腺癌、癌旁组织、细胞HOXA9、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白表达,统计裸鼠成瘤体积、质量、肝转移灶数量,免疫组化检测肿瘤HOXA9、β-catenin表达情况。结果qRT-PCR检测结果显示,乳腺癌组织miR-96-5p水平升高(P<0.05),HOXA9水平降低(P<0.05)。miR-96-5p高表达与肿瘤大小≥3 cm、淋巴结转移阳性、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期相关(P<0.05)。抑制miR-96-5p表达可降低MDA-MB-231、MCF-7细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力、Wnt-1、β-catenin、Cyclin D1表达水平、裸鼠肿瘤体积、质量、肝转移灶数量(P<0.05),提高HOXA9表达水平(P<0.05)。miR-96-5p靶向调控HOXA9表达,过表达HOXA9可逆转miR-96-5p对乳腺癌细胞恶性生物学行为的促进效果。结论miR-96-5p通过抑制HOXA9表达激活Wnt/β-catenin信号通路,促进乳腺癌发展。

NKX2-1-AS1介导miR-96-5p/PRDM16轴对未分化甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)NK2同源异形盒1-反义RNA 1(NKX2-1-AS1)介导微RNA(miR)-96-5p/含有PR结构域的蛋白16(PRDM16)轴对未分化甲状腺癌(ATC)细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长的影响。方法基于生物信息学筛选ATC组织及细胞中差异表达的lncRNA NKX2-1-AS1,并进一步筛选其靶基因miR-96-5p和下游靶基因PRDM16。双荧光素酶报告基因实验验证NKX2-1-AS1与miR-96-5p以及miR-96-5p与PRDM16之间的关系。Western blotting检测过表达miR-96-5p对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞PRDM16表达的影响。平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验分别检测敲减PRDM16对过表达NKX2-1-AS1的CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响。裸鼠皮下注射CAL-62细胞,观察敲减PRDM16对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞移植瘤生长的影响。结果基于生物信息学筛选出参与调节ATC发展的NKX2-1-AS1/miR-96-5p/PRDM16轴。双荧光素酶报告基因实验验证结果显示NKX2-1-AS1与miR-96-5p、miR-96-5p与PRDM16结合。过表达NKX2-1-AS1上调CAL-62细胞中PRDM16蛋白表达;而过表达miR-96-5p可逆转此上调作用。过表达NKX2-1-AS1抑制CAL-62细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长;而敲减PRDM16可逆转此抑制作用。结论NKX2-1-AS1可能作为竞争性内源性RNA与miR-96-5p竞争结合下游靶基因PRDM16,上调PRDM16表达,从而抑制ATC细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长。

miR-96-5p靶向FOXO1调节脑缺血再灌注损伤机制

目的:探究miR-96-5p在脑缺血再灌注损伤(CIRI)中的作用及机制。方法:通过qRT-PCR检测36例确诊的缺血性脑卒中患者(IS患者组)和30例健康体检者(健康组)的血清miR-96-5p水平。将PC12细胞分为5组:对照组、NC-ag组、miR-96-5p-ag组、NC-an组、miR-96-5p-an组。采用Lipofectamine 2000对PC12细胞进行转染,通过qRT-PCR验证转染效率。将PC12细胞分为6组:对照组、氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)组、OGD/R+NC-ag组、OGD/R+miR-ag组、OGD/R+NC-an组、OGD/R+miR-an组。根据分组对PC12细胞进行OGD/R处理和转染。通过MTT法检测PC12细胞活力,TUNEL法检测PC12细胞凋亡。采用改良Longa法建立大鼠CIRI模型,然后将大鼠分为假手术组、CIRI组、CIRI+NC-an组和CIRI+miR-an组。假手术组和CIRI组大鼠尾静脉注射生理盐水,CIRI+NC-an组和CIRI+miR-an组大鼠分别尾静脉注射NC-antagomir和miR-96-5p-antagomir。然后检测各组大鼠的神经功能评分、脑梗死体积和脑组织细胞凋亡情况。按照试剂盒说明书测定PC12细胞和大鼠脑组织中MDA、SOD和GSH-Px的含量。通过qRT-PCR检测PC12细胞和大鼠脑组织miR-96-5p和Forkhead box O1(FOXO1)m RNA水平,通过Western blot检测FOXO1、Ac-FOXO1、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。结果:与Health组比较,IS组患者的血清miR-96-5p水平显著升高(P<0.001)。与对照组和NC-ag组比较,miR-96-5p-ag组的miR-96-5p水平升高,FOXO1的m RNA和蛋白表达水平均降低,FOXO1的乙酰化水平升高(P<0.05)。与对照组和NC-an组比较,miR-96-5p-an组的miR-96-5p水平降低,FOXO1的m RNA和蛋白表达水平均升高,FOXO1的乙酰化水平降低(P<0.05)。与OGD/R组和OGD/R+NC-an组比较,OGD/R+miR-an组的相对细胞活力升高,TUNEL阳性率降低,Bax的蛋白相对表达量降低,Bcl-2的蛋白相对表达量升高,MDA水平降低,SOD和GSH-Px水平升高,miR-96-5p水平降低,FOXO1的m RNA和蛋白表达水平升高,FOXO1的乙酰化水平降低(P<0.05)。与CIRI组和CIRI+NC-an组比较,CIRI+miR-an组大鼠的神经功能评分和脑梗死体积降低,TUNEL阳性率降低,Bax的蛋白相对表达量降低,Bcl-2的蛋白相对表达量升高,MDA水平降低,SOD和GSH-Px水平升高,miR-96-5p水平降低,FOXO1的m RNA和蛋白表达水平升高,FOXO1的乙酰化水平降低(P<0.05)。结论:miR-96-5p在CIRI发生过程中表达上调,而下调miR-96-5p表达可能通过负调控FOXO1以减轻CIRI程度。