利用靶拟态合成和Gateway技术构建水稻miR164c沉默突变体

以水稻基因组DNA为模板,PCR扩增得到与miR399互补的Os MIM399后,改造成与miR164c互补的靶拟态序列Os MIM164c,经测序分析后连入p GWC载体,获得入门载体p GWC-Os MIM164c;利用Gateway技术,将入门载体p GWC-Os MIM164c经LR反应连接到植物表达载体GCS中,获得GCS-Os MIM164c表达载体,经农杆菌介导将该表达载体导入水稻品种Kasalath的愈伤组织中,组织培养后获得再生植株并进行目的基因的PCR鉴定,Real Time PCR方法检测阳性突变体植株中miR164c的表达量.研究结果表明,miR164c在突变体植株中的表达量显著低于野生型,说明miR164c沉默突变体构建成功.

miR164c和miR168b的表达与水稻种子活力的相关性研究

目的:探讨miRNA的表达差异与水稻种子活力的相关性。方法:通过人工老化处理获得不同活力的水稻种子,然后运用real time qPCR技术,对不同活力种子的胚中miR164c和miR168b的表达量进行相对定量分析。结果:水稻种子随活力下降至丧失活力以前,miR164c的表达量也相应下降;但丧失活力的种子中,miR164c的表达量显著回升。miR168b的表达量则随着种子活力的降低而呈先升后降的模式;在死种子中,miR168b的表达量维持在较低的水平。结论:初步推测miR164c和miR168b的表达量与调控水稻种子活力的变化相关,但它们的调控机制可能存在差异。

Pri-osa-miR164c转化介导水稻‘Kasalath’基因组和种子抗老化能力的变化

基因工程技术是未来提高种子抗老化能力的理想途径。种子人工老化试验结果表明,水稻(Oryza sativa)‘Kasalath’与其农杆菌转导pri-osa-miR164c突变体株系L8-1-2和L8-2-6-1的种子抗老化能力存在显著差异。q RTPCR和基因组重测序分析显示,一方面, L8-1-2和L8-2-6-1种子的miR164c表达量分别低于和高于野生型;另一方面, L8-1-2和L8-2-6-1的基因组发生了大量的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)和插入/缺失(insertion/deletion, InDel)突变且存在显著差异。因此推测pri-osa-miR164c导入‘Kasalath’后引起miR164c的差异表达和基因组变异可能是突变体株系L8-1-2、L8-2-6-1种子抗老化能力或种子活力发生变化的一个重要原因。