苜蓿源miR168b通过靶向肉碱棕榈酰转移酶1A对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和脂滴积累的调控研究

本试验旨在探究苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖和凋亡的影响。试验首先通过CCK8、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、流式细胞术、基因和蛋白定量等方法检测苜蓿源-miR168b(mtr-miR168b)对BMECs增殖、凋亡和周期的影响。然后,敲低mtr-miR168b靶基因肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)表达后,检测了BMECs的活力和凋亡。通过诱导转染后细胞,用氟硼二吡咯(Bodipy)染色和油红O染色检测mtr-miR168b和CPT1A基因干扰对BMECs脂滴合成的影响。结果表明:1)mtr-miR168b高表达极显著降低了BMECs活力(P<0.01)。2)mtr-miR168b高表达极显著抑制了BMECs增殖(P<0.01),延长了细胞G1~S期进程,极显著促进了细胞凋亡(P<0.01)。3)mtr-miR168b在BMECs中高表达极显著抑制了细胞增殖基因周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)的基因的表达水平(P<0.01),极显著增加了凋亡标志基因Bcl2关联X蛋白(BAX)基因的表达水平(P<0.01),极显著抑制了PCNA蛋白表达水平(P<0.01),极显著增加了BAX蛋白表达水平(P<0.01),并且mtr-miR168b显著抑制了蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表达水平(P<0.05)。4)mtr-miR168b高表达抑制了BMECs中脂滴的积累。5)干扰mtr-miR168b的靶基因CPT1A,对BMECs脂滴积累也有抑制作用。综上所述,mtr-miR168b可通过抑制BMECs增殖,促进细胞凋亡,并通过靶向CPT1A基因抑制BMECs中脂滴的生成。试验结果可为mtr-miRNAs调控牛奶乳脂合成提供分子层面的技术支撑。

苜蓿源miR168b跨界调控奶牛体内乳脂相关靶基因的筛选

筛选出高乳脂奶牛和低乳脂奶牛血液和牛奶中显著差异表达的苜蓿来源miRNAs及其在奶牛体内的潜在靶基因,可为进一步探究苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)在基因水平调节牛奶乳脂率奠定基础。试验首先对生产4胎,日粮水平一致的荷斯坦奶牛牛奶进行了奶牛生产性能(dairy herd improvement,DHI)检测,在高乳脂和低乳脂奶牛中各选3头作为重复。运用RT-qPCR对奶牛血液和牛奶中的苜蓿源miRNAs进行定量,筛选出差异表达miRNAs后对其进行靶基因预测和分析,并根据miRNA-mRNA结合位点和定量结果筛选出与乳脂代谢相关的靶基因。结果如下:1)DHI检测筛选出了3头高乳脂奶牛和3头低乳脂奶牛,高乳脂奶牛牛奶中脂肪含量>4.2%,低乳脂奶牛牛奶中脂肪含量<3.5%;2)苜蓿源novel-miR54、miR156f、miR166a、miR168b和miR168c-3p在奶牛血液和牛奶中均能检测到,其中mtr-miR168b在高乳脂奶牛血液中的表达量极显著低于在低乳脂奶牛中的表达量(P<0.01),在高乳脂奶牛牛奶中的表达量显著低于在低乳脂奶牛中的表达量(P<0.05);3)mtr-miR168b在乳腺上皮细胞中高表达抑制了其中脂代谢标志基因PPARγ,SCD1,CEBP/β和SREBP1的表达量;4)mtr-miR168b预测靶基因分别有1834和296个与GO和KEGG数据库比对成功,靶基因主要与N-聚糖生物合成(3.72%)、cGMP-PKG信号通路(2.37%)和血管平滑肌收缩(2.37%)密切相关,甘油磷脂代谢(1.69%)通路也被显著富集;5)筛选出CPT1A和STARD7两个与脂代谢密切相关的基因,并通过双荧光素酶报告确认了miR-168b和CPT1A与STARD7的靶向关系。由此可见,mtr-miR168b可抑制乳腺上皮细胞中的成脂标志基因的表达,试验为后续验证苜蓿源miRNAs调控奶牛乳脂率提供了可进一步验证的靶基因。

miR164c和miR168b的表达与水稻种子活力的相关性研究

目的:探讨miRNA的表达差异与水稻种子活力的相关性。方法:通过人工老化处理获得不同活力的水稻种子,然后运用real time qPCR技术,对不同活力种子的胚中miR164c和miR168b的表达量进行相对定量分析。结果:水稻种子随活力下降至丧失活力以前,miR164c的表达量也相应下降;但丧失活力的种子中,miR164c的表达量显著回升。miR168b的表达量则随着种子活力的降低而呈先升后降的模式;在死种子中,miR168b的表达量维持在较低的水平。结论:初步推测miR164c和miR168b的表达量与调控水稻种子活力的变化相关,但它们的调控机制可能存在差异。