miR302/367簇对肝癌细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的探讨miR302/367簇在肝癌发生、发展过程中的作用及机制。方法通过实时定量PCR检测肝癌细胞系(Bel-7402、Hep G2、MHCC97、SMMC-7721)中miR302/367簇的表达;在Hep G2、MHCC97肝癌细胞系中建立miR302/367簇过表达体系,通过细胞计数实验、MTT实验和异种移植瘤模型检测肝癌细胞体内、体外增殖和生长能力;利用流式细胞术,通过PI染色,检测肝癌细胞周期分布。结果 miR302/367簇在四个肝癌细胞系中均不表达;过表达miR302/367簇后,肝癌细胞体内、体外的增殖和生长能力均明显受抑制,其G0/G1期比例显著增加,而S期比例明显减少(P均<0.05)。结论 miR302/367簇通过阻滞细胞从G0/G1期向S期转换抑制肝癌细胞的增殖。

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW。方法NheⅠ和NotⅠ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302;BamHⅠ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物,并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的SolutionI将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序。所构建载体命名为pFUM3GW。获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系。结果PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F。结论成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础。

胚胎癌F9细胞中Oct4在miRNA302启动子上的募集

目的检测胚胎癌F9细胞中Oct4是否能在miR302启动子上募集。方法采用荧光半定量Real-time PCR检测F9细胞中Oct4RNA干扰后Oct4及miR302表达量的变化,采用染色质免疫沉淀技术(CHIP)检测F9细胞中Oct4在miR302启动子上募集的情况。结果 (1)Oct4 RNA干扰后Oct4表达下降了56%,miR302的表达下降了38%,两者具有相似的表达趋势。(2)Oct4能在miR302启动子上募集。结论 F9细胞中Oct4及miR302的表达具有相关性,miR302启动子上有Oct4募集,Oct4对miR302启动子具有调节作用,miR302可能是Oct4的靶基因之一。