非洲猪瘟病毒pK205R蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、重复性,并对临床血清样品进行检测。结果显示:pK205R蛋白可以与ASFV阳性血清发生发应,ELISA方法的抗原包被浓度为50 ng/孔,4℃过夜包被,封闭液为2%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭1 h,待检血清以5%脱脂乳进行1∶200稀释,37℃孵育0.5 h;二抗工作浓度为1∶5000,37℃孵育0.5 h,37℃下显色10 min;该方法的阳性临界值为0.186(≥0.186为阳性,<0.186为阴性),且具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒符合率为79.92%。本研究成功建立pK205R非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制非洲猪瘟抗体的快速检测试剂盒提供了参考。

miRNA-378a过表达巨噬细胞株复合胶原蛋白海绵:抗炎及促进组织修复

背景:巨噬细胞M1/M2极化方向的调节在组织工程应用中尤为关键,及时调控可最大程度地减少促炎、促进抗炎或组织愈合反应。目的:将慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞株复合胶原蛋白海绵回植入动物模型,据此检测免疫调节在体内环境中的相关表达水平等组织修复相关的指标,进一步阐明在体内环境中miRNA-378a是否促进巨噬细胞M2极化及其对免疫调节和组织修复的作用。方法:将慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞株、阴性对照病毒巨噬细胞株扩增、筛选,复苏培养巨噬细胞株后与胶原蛋白海绵共培养以此构成复合体,具体分组如下:①阳性组:过表达miRNA-378a巨噬细胞-胶原蛋白海绵复合体;②阴性组:阴性对照病毒介导的miRNA-378a巨噬细胞-胶原蛋白海绵复合体;③对照组:巨噬细胞-胶原蛋白海绵;④空白对照组:胶原蛋白海绵。通过免疫荧光及扫描电镜观察各组细胞密度、表型、黏附情况,后回植入小鼠背部皮下模型,分别于造模后4,7 d处死小鼠,通过大体观察、苏木精-伊红染色、Masson染色、免疫组化分析慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞胶原蛋白海绵复合体中巨噬细胞极化的方向及其对机体免疫调控、组织修复的作用。结果与结论:①免疫荧光镜下观察各组巨噬细胞株确实与胶原蛋白海绵形成复合体;②扫描电镜下慢病毒介导的miRNA-378a巨噬细胞(阳性组)较其他分组细胞密度增加,细胞出现球形、椭圆形及多边形分化,具有更多的伪足;③大体观察下总体7 d愈合好于4 d,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)无论4,7 d愈合均好于其他分组;④苏木精-伊红染色、Masson染色下,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)具有较多量的纤维细胞、毛细血管、成纤维细胞以及胶原纤维增生;⑤免疫组化显示,慢病毒介导的miRNA-378a过表达巨噬细胞(阳性组)无论4,7 d M2极化细胞阳性率均大于其他分组;对照组及阴性组巨噬细胞无论4,7 d M2极化细胞阳性率均大于空白对照组,而对照组及阴性组之间无统计学差异;阳性组、阴性组、对照组无论4,7 d染色细胞数量均大于空白对照组,且阳性组>阴性组≈对照组>空白对照组;⑥提示在体内环境中miRNA-378a过表达巨噬细胞具有较多量的纤维细胞、毛细血管、成纤维细胞以及胶原纤维增生,对组织修复起到了正向作用,并且能促进巨噬细胞向M2型极化并抑制M1型极化,从而有助于减少机体炎症反应。

miRNA-99b、LL-37、IP-10在耐多药肺结核患者中表达及早期疗效预测价值

目的 分析微小RNA-99b(miRNA-99b)、抗菌肽LL-37、干扰素-γ诱导蛋白10(IP-10)在耐多药肺结核(MDR-PTB)患者中表达及早期疗效预测价值。方法 研究纳入医院2022年11月-2024年2月临床收治MDR-PTB患者108例为MDR-PTB组,Bandim TBscore评分法将其划分为轻度组(n=71)与中-重度组(n=37);纳入同期非耐药肺结核患者(DS-PTB)87例为DS-PTB组,健康体检志愿者90例为健康对照组,检测、评估组间miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平及治疗8周后临床疗效,采用Pearson评估miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平与MDR-PTB患者临床疗效相关性,指标预测价值行多因素Logistic回归,作ROC曲线分析模型预测价值。结果 MDR-PTB组miRNA-99b、LL-37、IP-10均高于DS-PTB组与健康对照组(P<0.05),且DS-PTB组miRNA-99b、LL-37、IP-10高于健康对照组(P<0.05);MDR-PTB组内,中-重度组miRNA-99b、LL-37、IP-10表达水平均高于轻度组(P<0.05);治疗4周、治疗8周后,MDR-PTB患者miRNA-99b、LL-37、IP-10均低于治疗前(P<0.05);108例MDR-PTB患者经8周治疗后临床有效率为88.89%;miRNA-99b、LL-37、IP-10均与有效率呈负相关关系(r=-0.693、-0.706、-0.497,P<0.05);miRNA-99b、LL-37、IP-10高水平表达为MDR-PTB发生发展独立危险因素,有统计学意义(P<0.05),ROC曲线分析显示,miRNA-99b、LL-37、IP-10联合检测AUC为0.937(95%CI:0.863~0.974)高于单一检测结果(Z=7.691、7.069、8.068,P均<0.001);且联合检测敏感度(96.91%)与特异度(96.34%)均最高。结论 miRNA-99b、LL-37、IP-10高水平表达参与MDR-PTB发生与发展,三项联合在MDR-PTB患者早期疗效预测中应用价值高。

miRNA-299-3p对胃癌AGS细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其机制

目的探索miRNA-299-3p对胃癌AGS细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移的影响,并进一步探索其机制。方法体外培养胃癌AGS细胞,并将其分为空白对照组、阴性对照组及实验组。利用qPCR检测miRNA-299-3p的表达,将空载体质粒和miRNA-299-3p质粒分别转染入AGS细胞;利用CCK-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期及活性氧水平变化情况;Transwell法检测细胞迁移和侵袭情况;Western blot检测相关蛋白表达量变化情况。结果CCK-8实验表明,miRNA-299-3p的高表达抑制AGS细胞增殖(P<0.05);流式细胞术及Western blot结果显示,miRNA-299-3p的高表达能够诱导AGS细胞凋亡,caspase-3和Bax表达量升高,Bcl-2蛋白表达量降低(P<0.05);同时,miRNA-299-3p过表达后,能够下调CDK1/2和Cyclin B1蛋白的表达量,将AGS细胞周期阻滞在G_(2)/M期;Transwell小室及Western blot实验结果表明,miRNA-299-3p过表达使N-cadherin蛋白表达量降低,E-cadherin蛋白表达量升高从而抑制AGS细胞迁移;另外,miRNA-299-3p过表达能够上调AGS细胞中活性氧水平。结论过表达miRNA-299-3能够通过上调细胞内活性氧水平,抑制AGS细胞的增殖、诱导AGS细胞发生凋亡、将细胞周期阻滞在G_(2)/M期、抑制迁移,为miRNA-299-3p在胃癌研究中提供一定的理论基础。

miRNA-205在猪卵母细胞成熟过程中表达规律及其调控作用的研究

本试验旨在探索miRNA-205在猪卵母细胞成熟过程中表达规律及其调控功能。应用生物学软件TargetScan和microRNA.org对miRNA-205靶基因进行预测,利用实时荧光定量PCR方法分别检测miRNA-205及其靶基因在猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)成熟过程中0、24和48h表达量。结果表明,miRNA-205在猪COCs成熟过程中表达呈上升趋势,0h表达量最低,48h表达量最高。添加FSH、LH和EGF的成熟液组与成熟基液组相比,miRNA-205表达量显著下调,长正五聚蛋白(PTX3)表达量极显著上调(P<0.01),PTX3与miRNA-205的表达量呈负相关,卵丘细胞扩散标记基因肿瘤致死因子(TNFAIP6)和透明质酸合成酶(HAS2)的表达量极显著上调(P<0.01)。由此推断,miRNA-205保守序列可能与PTX3基因3′-UTR区特异性结合参与卵丘细胞扩散的调控。

miRNA-205在食管鳞状细胞癌患者组织中的表达及临床意义

目的探讨miRNA-205在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）患者组织中的表达情况。方法收集56例经病理确诊的ESCC患者的手术切除组织（癌组织及其癌旁组织）,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测miRNA-205的表达,并分析miRNA-205在不同临床病理资料之间的差异。结果 ESCC患者组织中miRNA-205相对表达量为1.475（0.444~5.478）,显著高于癌旁组织（Z=-3.067,P=0.002）;miRNA-205在不同TNM分期ESCC患者组织中存在差异,TNM分期越高,miRNA-205表达量越高,差异具有统计学意义（F=36.335,P〈0.001）;miRNA-205在淋巴结转移阴性/阳性组织中存在差异,淋巴结转移阳性组miRNA-205表达量显著高于淋巴结转移阴性组（Z=-3.353,P=0.001）。结论 miRNA-205在ESCC患者癌组织中表达升高,并可能参与ESCC的发生与发展。

miRNA-223、miRNA-21及miRNA-27a与冠心病冠脉病变的关系

目的 探讨miRNA-223、miRNA-21及miRNA-27a与冠心病冠脉病变的关系。方法 选取2021年1月至2022年12月商丘市第一人民医院收治的CHD患者86例为观察组,选取70名同期院内健康体检者作为对照组。对比两组血清miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a水平;分析影响CHD冠脉病变的单因素,采用Logistic回归分析影响CHD冠脉病变的单因素、多因素;对比不同CHD冠脉病变类型的血清miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a水平;对比不同CHD冠脉病变支数的血清miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a水平。结果 观察组miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a表达水平比对照组高,差异有统计学意义(P<0.05);Logistic多因素分析显示,患有高血压、糖尿病以及miRNA-223>1.5、miRNA-21>6.0、miRNA-27a>5.5均是影响CHD冠脉病变的独立危险因素(P<0.05);miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a表达水平:急性心肌梗死>不稳定型心绞痛>稳定型心绞痛,差异有统计学意义(P<0.05);miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a表达水平:三支>双支>单支,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 不同冠脉病变CHD患者miRNA-223、miRNA-21、miRNA-27a表达水平不同,提示以上指标对判断CHD患者冠脉病变类型具有一定的临床价值。

miRNA-205与肿瘤

小分子RNA（miRNAs）是内源性非编码小RNA，大约由21～25个核苷酸组成。1993年，Lee等[1]首先发现在线虫体内存在一种RNA（1in4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3UTR区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。

miRNA-205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用

目的:构建miRNA-205过表达载体并研究miRNA-205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法:对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA-205前体序列,并将其克隆于基础表达载体p CAGDNA3-h Fat1,构建过表达载体p CAG-miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞(含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA-205的表达情况,比较分析miRNA-205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果:成功构建了p CAG-miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA-205表达量显著升高(P<0.01);利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论:研究结果表明在细胞水平上过表达micro RNA-205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA-205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA-205的细胞系,为进一步深入研究miRNA-205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。

抑制miRNA-376c-3p对肾透明细胞癌生长的影响

目的探究miRNA-376c-3对肾透明细胞癌(ccRCC)中肿瘤细胞生长的影响。方法以实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测人ccRCC细胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN及正常人近段肾小管上皮细胞系HKC中miRNA-376c-3p的表达。体外培养786-O细胞,随机分为对照组、miR-376c-3p inhibitor组(转染miR-376c-3p inhibitor)、miR-376c-3p mimics组(转染miR-376c-3p mimics)、阴性对照组(转染miR-376c-3p阴性对照),分组转染后以RT-PCR检测4组细胞miRNA-376c-3p表达;以Ki67免疫荧光染色、集落生成实验检测4组786-O细胞增殖;以TUNEL染色检测4组786-O细胞凋亡;以免疫荧光染色检测4组786-O细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达并比较其Bax/Bcl-2。于右腋窝皮下接种上述4组786-O细胞建立其裸鼠移植瘤模型,3周后测定其肿瘤体积与质量;以Ki67免疫荧光染色、TUNEL染色分别检测4组裸鼠肿瘤细胞增殖与凋亡。结果与HKC细胞比较,ccRCC细胞系786-O、Caki-1、SN12-PM6、ACHN中miR-376c-3p表达降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-376c-3p inhibitor组细胞增殖率与集落形成率、肿瘤体积与质量、裸鼠肿瘤组织Ki67阳性比升高(P<0.05),细胞miR-376c-3p相对表达、Bax/Bcl-2与凋亡率、裸鼠肿瘤组织TUNEL阳性比降低(P<0.05);miR-376c-3p mimics组细胞增殖率与集落形成率、肿瘤体积与质量、裸鼠肿瘤组织Ki67阳性比降低(P<0.05),细胞miR-376c-3p相对表达、Bax/Bcl-2与凋亡率、裸鼠肿瘤组织TUNEL阳性比升高(P<0.05);阴性对照组各指标无明显变化(P>0.05)。结论抑制miRNA-376c-3p可削弱ccRCC细胞增殖及集落生成活性,促进其凋亡,并在裸鼠体内抑制其移植瘤生长。

超声及血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363联合诊断PTMC颈部淋巴结转移的临床价值

目的 研究超声及血清细胞角蛋白19(CK-19)、半乳糖凝集素3(Galectin-3)及微小核糖核酸-363(miRNA-363)联合诊断甲状腺微小乳头状癌(PTMC)颈部淋巴结转移(CLNM)的临床价值。方法 回顾性选取2021年7月至2023年6月在天津市环湖医院诊断的PTMC患者92例纳入研究组,选择同期本院收治的结节性微小甲状腺肿患者92例纳入对照组。观察两组病灶情况及超声特点;比较两组血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363水平,研究组是否发生CLNM患者病灶超声特点及血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363水平。分析PTMC~CLNM超声特点与血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363水平的相关性。结果 研究组多枚病灶、病灶>0.5 mm、病灶纵横比≥1、病灶形态不规则、病灶边缘模糊、病灶微钙化、病灶低回声、淋巴结肿大占比分别为70.65%、71.74%、82.61%、61.96%、72.83%、80.43%、84.78%、70.65%,均大于对照组(31.52%、52.17%、27.17%、25.00%、19.57%、15.22%、66.30%、22.83%),差异均有统计学意义(P<0.05)。研究组血清CK-19、Galectin-3水平分别为(30.45±3.31)、(4.68±0.48)μg/L,均高于对照组[(7.05±0.73)、(1.72±0.19)μg/L],血清miRNA-363水平为(2.89±0.30) fmol/L,低于对照组[(4.30±0.46) fmol/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。研究组发生CLNM患者多枚病灶、病灶形态不规则、病灶边缘模糊、病灶微钙化、淋巴结肿大占比分别为90.91%、86.36%、95.45%、100.00%、90.91%,均大于未发生CLNM患者(64.29%、54.29%、0、25.00%、64.29%),差异均有统计学意义(P<0.05)。研究组发生CLNM患者血清CK-19、Galectin-3水平(41.20±4.42)、(5.94±0.62)μg/L,均高于未发生CLNM患者[(24.36±2.71)、(3.25±0.34)μg/L],血清miRNA-363水平为(2.14±0.23) fmol/L,低于未发生CLNM患者[(3.46±0.36) fmol/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。经Pearson相关分析,CLNM患者多枚病灶、病灶形态不规则、病灶边缘模糊、淋巴结肿大及血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363水平均与CLNM呈正相关(P<0.05)。结论 超声及血清CK-19、Galectin-3、miRNA-363联合诊断PTMC~CLNM具有较高的临床价值。

miRNA-205调控靶基因的研究进展与趋势

传统的miRNA-靶基因-生物学功能研究思路忽略了靶基因之间、靶基因所在信号通路之间的联系,使得miRNA调控作用的整体性与关联性无法得到全面的阐释。运用整体、系统且联系的思维方式,通过对荧光素酶报告实验验证的miR-205靶基因及其信号通路的整理和分析,将明确miR-205的研究方向,并为突破现有miRNA研究的整体格局,探索新颖的miRNA调控机制提供帮助。

血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行根治性前列腺切除术老年前列腺癌患者预后的评估价值

目的分析血清微小RNA(miRNA)-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行腹腔镜根治性前列腺切除术(LRP)的老年前列腺癌患者预后的评估价值。方法选取2014年1月至2018年9月该院收治的行LRP治疗的213例老年前列腺癌患者作为研究对象,根据5年随访结局将患者分为预后优良组(87例)和预后不良组(126例)。收集患者术前临床基线资料及血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平。采用Logistic回归分析筛选影响患者预后的因素,并以独立危险因素构建预后预测模型,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析其预测价值。结果多因素Logistic回归分析结果显示,患者血清前列腺特异性抗原(PSA)水平、切缘阳性、血清miRNA-21-5p与miRNA-5189-5p表达水平均为行LRP的老年前列腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),以独立危险因素构建联合预测模型,各因素单独预测行LRP的老年前列腺癌患者预后的曲线下面积均小于4项联合(P<0.05)。结论血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行LRP的老年前列腺癌患者预后的预测具有较高价值。

肾衰饮对肾间质纤维化大鼠miRNA-21/PTEN/AKT/自噬途径的作用及影响

目的以miRNA-21/PTEN/AKT/自噬途径为切入点,探讨肾衰饮改善肾间质纤维化大鼠的作用及机制。方法将60只雄性SD大鼠适应性喂养3 d后,按体重随机分为两组,即假手术组10只,模型组50只,采用左侧输尿管结扎术建立肾间质纤维化大鼠模型。造模成功后,将大鼠再随机分为组:模型组,肾衰饮低剂量组,肾衰饮中剂量组,肾衰饮高剂量组及尿毒清组。分别按人与大鼠1∶1/2,1∶1,1∶2和1∶1灌胃各给药组大鼠,假手术组与模型组给予生理盐水0.15ml/10g灌胃,M组:9.56 g/kg/d。实验期间进行一般情况观察,灌胃治疗14d后结束实验,各组大鼠禁食、不禁水12h,第二日早8:00称重,进行取材。收集24小时尿,全自动生化分析仪一次性检测尿肌酐(UCr)、微球蛋白(β2-MG)及尿微量白蛋白(mAlb)含量,髂总动脉分支处穿刺采血测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量;HE染色和Masson染色观察肾脏组织病理学改变及胶原沉积情况;免疫组织化学法检测肾脏组织相关蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测肾脏组织miRNA21及相关mRNA的表达水平;免疫印迹法(Western Blot)检测肾脏组织相关蛋白表达水平。结果与假手术组大鼠比较,模型组大鼠精神倦怠,明显消瘦,排便、排尿异常。Scr、BUN、Ucr、β2-MG、mAlb显著升高(P<0.01)。模型组HE染色肾组织结构紊乱,肾小管官腔明显扩张,排列稀疏,肾小管间质明显增宽,间质内有炎性细胞浸润;Masson模型组肾间质区及系膜区增宽伴大量胶原纤维沉积;肾脏组织miR-21、p62、FN、CollagenⅢmRNA的表达显著增高(P<0.01或P<0.05),PTEN、Atg13、LC3、Beclin-1mRNA的表达显著降低(P<0.01或P<0.05);肾脏组织FN、CollagenⅢ、p62、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR蛋白水平显著增高(P<0.01);PTEN、Atg13、LC3、Beclin-1蛋白水平显著降低(P<0.01或P<0.05)。经给药治疗后,各给药组大鼠上述指标均明显好转(P<0.01或P<0.05),其中以肾衰饮高剂量组最为显著,明显优于尿毒清组(P<0.01或P<0.05)。结论肾衰饮可能通过下调miR-21及其介导的PTEN/AKT/m TOR通路,从而促进自噬的发生而有效延缓肾间质纤维化的发生发展。

胎衣不下奶牛miRNA-185靶向调控血管内皮生长因子A表达的研究

【目的】通过体内和体外试验检测miRNA-185及血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)在胎衣正常排出和胎衣不下(RFM)奶牛胎盘组织中的差异表达情况及VEGFA在奶牛母体胎盘组织中表达分布,验证及明确miRNA-185和VEGFA与奶牛胎衣不下发生密切相关并存在靶向调节关系,为深入研究miRNA-185在奶牛胎衣不下发生过程中的作用提供理论依据和试验基础。【方法】采用实时荧光定量PCR法检测胎衣正常排出及胎衣不下奶牛母体胎盘组织中miRNA-185及VEGFA基因表达情况,采用荧光原位杂交技术(FISH)检测VEGFA在母体胎盘组织的表达分布及mRNA的差异表达情况;采用双荧光素酶明确miRNA-185与VEGFA的靶向调节关系,采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测体外转染miRNA185 mimics、miRNA-185 inhibitor及miRNA-185 NC后VEGFA mRNA及蛋白的差异表达情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,与胎衣正常排出奶牛相比,胎衣不下奶牛体内miRNA-185及VEGFA的表达水平均极显著下调(P<0.01);荧光原位杂交结果显示,VEGFA mRNA主要在奶牛子宫内膜上皮细胞中表达。VEGFA是miRNA-185的靶向调节蛋白。与阴性对照组相比,转染miRNA-185 mimics后VEGFA的mRNA及蛋白表达水平均极显著下调(P<0.01),转染miRNA-185 inhibitor后VEGFA的mRNA及蛋白表达水平均极显著上调(P<0.01)。【结论】胎衣不下奶牛母体胎盘组织内miRNA-185及VEGFA表达显著降低,VRGFA主要在子宫内膜上皮细胞中表达,miRNA-185可通过靶向调控VEGFA的表达参与奶牛胎衣不下的发生发展。

miRNA-432-5p在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制研究

目的探讨miRNA-432-5p在脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制。方法人肺泡上皮细胞A549随机分为对照组、LPS组、miRNA-432-5p mimics组及miRNA-432-5p siRNA组。利用CCK-8实验检测细胞的活性;利用ELISA法检测细胞培养液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量;利用RT-qPCR检测细胞中miRNA-432-5p mRNA的表达;利用Hoechst染色检测细胞的凋亡情况;利用Western blot检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase1)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达。结果LPS组细胞的活性OD值(6 h:0.809±0.09;12 h:0.601±0.09;24 h:0.485±0.43)明显低于对照组的1.000±0.00,差异均具有统计学意义(P<0.05);LPS组细胞中miRNA-432-5p mRNA表达水平为1.563±0.10,明显高于对照组的1.000±0.00,细胞凋亡率为(41.52±1.83)%,明显高于对照组的(0.000±0.00)%,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,明显高于对照组的(5.27±0.84)pg/mL、(5.57±0.65)pg/mL、(3.26±0.85)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05),LPS组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,明显高于对照组的0.163±0.03、0.025±0.01、0.032±0.01,差异均具有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p mimics组细胞凋亡率为(24.23±3.09)%,明显低于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.639±0.09,明显高于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(22.85±4.01)pg/mL、(29.15±5.22)pg/mL、(20.63±3.89)pg/mL,明显低于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.473±0.04、0.121±0.02、0.279±0.04,明显低于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p siRNA组细胞凋亡率为(56.44±3.25)%,明显高于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.348±0.06,明显低于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(51.08±4.12)pg/mL、(53.61±4.83)pg/mL、(59.97±3.62)pg/mL,明显高于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.969±0.12、0.430±0.09、0.575±0.07,明显高于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-432-5p可通过抑制NLRP3炎性小体通路的激活,对受损细胞发挥保护作用。

miRNA-5582在卵巢癌组织中的表达及对卵巢癌细胞增殖和侵袭的影响

目的观察微小RNA(miRNA)-5582对卵巢癌SK-OV-3细胞增殖和侵袭的影响并探讨其可能的机制。方法采用加利福尼亚大学圣克鲁兹分校(UCSC)数据库分析miRNA-5582在卵巢癌组织中的表达及其与卵巢癌患者临床分期的关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测卵巢癌细胞株A2780、HO-8910、OC3、SK-OV-3和正常卵巢上皮细胞株IOSE80中miRNA-5582的表达,miRNA-5582表达最低的SK-OV-3细胞株分为对照组和miRNA-5582组,分别转染miR-NC模拟物和miRNA-5582模拟物。MTS法和Transwell实验分别检测SK-OV-3细胞增殖及侵袭。以microRNA.org和miRWalk3.0数据库检索miRNA-5582的靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-5582的靶基因。qRT-PCR和Western blot法检测靶基因表达。结果miRNA-5582在卵巢癌组织中的表达显著低于正常组织(P<0.01)。miRNA-5582表达水平与卵巢癌患者的临床分期呈负相关(P<0.01)。miRNA-5582在卵巢癌细胞株中表达均显著低于IOSE80细胞(P<0.05),SK-OV-3细胞中miRNA-5582表达最低(P<0.01)。对照组和miRNA-5582组的miRNA-5582相对表达量为1.42±0.73和10.46±0.91,转染体系构建成功(P<0.01)。miRNA-5582组SK-OV-3细胞活性在第3、第4和第5天显著低于对照组(P<0.05)。对照组和miRNA-5582组侵袭细胞数分别为(49.48±3.78)和(15.77±3.40)个,miRNA-5582组细胞侵袭数量显著少于对照组(P<0.01)。miRNA-5582的靶基因是丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3(SRSF3)(P<0.01)。miRNA-5582组SK-OV-3细胞SRSF3基因表达显著低于对照组(P<0.01)。结论miRNA-5582在卵巢癌组织和细胞株中低表达,上调miRNA-5582通过抑制SRSF3基因表达降低卵巢癌SK-OV-3细胞的增殖和侵袭能力,miRNA-5582可能为卵巢癌的防治提供新的靶点。

miRNA-106a和miRNA-20a与新生儿呼吸窘迫综合征严重程度及预后的关系

目的探讨血清微小RNA(miRNA)-106a和miRNA-20a水平与新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)严重程度及预后的相关性。方法选取2021年3月至2024年4月在西安交通大学附属红会医院就诊的156例NRDS患儿为NRDS组,其中男77例,女79例,出生胎龄(33.87±2.01)周。根据NRDS患儿胸部影像检查结果将其分为轻度组(50例)、中度组(74例)和重度组(32例)。根据NRDS患儿结局将其分为预后良好组132例和预后不良组24例。另选取同期在西安交通大学附属红会医院体检的健康早产儿150例作为对照组,其中男77例,女73例,出生胎龄(34.05±1.83)周。采用定量聚合酶链式反应(qPCR)测定血清miRNA-106a和miRNA-20a水平;采用Pearson相关分析NRDS患儿血清miRNA-106a和miRNA-20a水平与新生儿急性生理评分(SNAPPE-Ⅱ)、1 min Apgar评分的相关性;采用受试者操作特征曲线(ROC)评价血清miRNA-106a和miRNA-20a水平预测NRDS患儿预后的价值。采用t检验、χ^(2)检验。结果NRDS组患儿血清miRNA-106a和miRNA-20a水平低于对照组[(0.97±0.30)比(1.70±0.53)、(0.88±0.32)比(1.57±0.55)],差异均有统计学意义(t=14.750、13.346,均P<0.05)。重度组、中度组、轻度组血清miRNA-106a和miRNA-20a水平及1 min Apgar评分比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。预后不良组NRDS患儿血清miRNA-106a和miRNA-20a水平低于预后良好组[(0.40±0.19)比(1.07±0.36)、(0.39±0.17)比(0.97±0.34)],SNAPPE-Ⅱ评分高于预后良好组[(34.25±6.50)分比(18.10±3.58)分],差异均有统计学意义(t=13.438、12.718、11.850,均P<0.05)。血清miRNA-106a和miRNA-20a水平与SNAPPE-Ⅱ评分呈负相关(均P<0.05),与1 min Apgar评分呈正相关(均P<0.05)。miRNA-106a、miRNA-20a预测NRDS患儿预后不良的灵敏度分别为95.8%、91.7%,特异度分别为93.2%、89.4%,曲线下面积(AUC)分别为0.961(95%CI 0.929~0.992)、0.938(95%CI 0.900~0.976),表明这些生物标志物预测NRDS患儿预后准确度较高。miRNA-106a联合miRNA-20a的灵敏度和特异度分别为91.7%、97.7%,AUC为0.984(95%CI 0.967~1.000),表明联合检测具有更高的预测效能。结论血清miRNA-106a和miRNA-20a水平在NRDS患儿中降低,且其水平随NRDS患儿严重程度加重而逐渐降低,二者在预测NRDS患儿预后中具有重要价值。

miRNA-195在腹主动脉瘤血管平滑肌细胞中作用机制探讨

目的探讨miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤中表达及对血管平滑肌细胞的作用。方法建立大鼠腹主动脉瘤模型,实时荧光定量PCR检测miRNA-195在腹主动脉瘤组织中的表达量;血管平滑肌细胞中转染miRNA抑制物,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,蛋白印迹法检测MMP-2、MMP-9和OPN蛋白表达。结果miRNA-195在大鼠腹主动脉瘤组织中呈高表达;血管平滑肌细胞中转染miRNA-195抑制物后,转染组细胞的增殖能力在48 h、72 h和96 h比对照组提高40.5%(P<0.05)、39.7%(P<0.01)、36.1%(P<0.001),且转染组细胞凋亡率比对照组降低35.6%(P<0.001),MMP-2蛋白、MMP-9蛋白和OPN蛋白在转染组中表达量分别比对照组降低45.4%、36.8%和48.8%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-195表达升高导致血管平滑肌细胞数量减少,并可能通过上调MMP-2和MMP-9蛋白表达致细胞外基质发生降解,从而促进腹主动脉瘤的形成和发展。

结合图自动编码器和结构化注意力机制的miRNA-疾病关联预测方法

MicroRNA(miRNA)-疾病关联预测的研究有助于人类进行疾病预防、诊断和治疗等,许多研究人员开发出了基于图自动编码器的miRNA-疾病关联预测方法,然而大多数编码器方法在对中心节点编码的时候并没有考虑到邻居节点之间的差异。因此,本文提出一种结合图自动编码器和结构化注意力机制的miRNA-疾病关联预测方法(SAAE)。SAAE模型使用基于图神经网络的编码器,该编码器采用多个编码层堆叠的方式以探索多阶邻居的信息。为了将中心节点与邻居节点不同权重的特征信息进行融合并捕获节点在图中的高阶结构信息,引进结构化注意力机制对图节点的原始信息进行编码,以生成新的特征信息。随后,通过解码器进行解码,解码后的特征信息使用随机森林算法挖掘miRNA和疾病节点之间的潜在联系。实验结果表明,SAAE在5倍交叉验证的曲线下的平均面积为94.53%。此外,本文还进行了关于肾脏肿瘤和肺部肿瘤的2个案例研究,验证了SAAE预测的有效性。