外泌体miRNA-148a-3p在胃肠间质瘤中的表达及临床意义

目的研究胃肠间质瘤患者血清外泌体中miRNA-148a-3p的表达情况及其与患者临床资料之间的关系。方法选择2020年6月—2021年6月本院收治的37例间质瘤患者和10名体检的健康人作为研究对象,分为间质瘤患者组和正常组两组。利用超速离心法提取间质瘤患者和健康人血清中的外泌体,采用高通量测序和qRT-PCR检测外泌体中miRNA-148a-3p的表达情况,并分析其表达和临床资料之间的关系。结果间质瘤患者血清外泌体中miRNA-148a-3p的表达水平较正常人明显升高,血清外泌体miRNA-148a-3p的水平与间质瘤患者性别、年龄无明显差异(P>0.05),与肿瘤大小、核分裂象、危险度分级呈正相关(P<0.05)。结论外泌体miRNA-148a-3p在间质瘤患者中特异性高表达,并且和预后不佳相关,提示外泌体miRNA-148a-3p可能成为间质瘤诊断和判断预后的标志物。

miRNA-148a-3p的生物信息学分析及其在小鼠不同组织中的表达水平检测

旨在研究小鼠不同组织中miR-148a-3p的表达情况,并对其进行生物信息学分析,构建miR-148a-3p基因相关网络,进一步阐明其在机体中的作用。本研究以6周龄雄性C57BL/6 J小鼠胃、肺、脾、皮肤、肝、心和肾7个组织为研究材料,每组3个重复,进行3次平行试验。利用qRT-PCR技术比较小鼠不同组织中miR-148a-3p的表达水平。在miBase上对miR-148a-3p在不同物种间的保守性进行分析,并通过Promoter Scan和TRANSFAC预测其转录因子结合位点。利用TargetScan、PicTar和miRanda预测miR-148a-3p的靶基因并取交集,并进行GO和KEGG分析。利用Cytoscape构建TF-miRNA-mRNA互作网络。qRT-PCR结果显示,在所有组织中,miR-148a-3p在脾中的表达水平最高(P<0.001),肝次之(P<0.001),在皮肤、胃、心、肾、肺中的表达水平逐渐降低。经预测bata-pol、CREB、E4F1、NF-S等多个转录因子可以与miR-148a-3p结合并调控其表达。GO富集和KEGG通路分析表明,miR-148a-3p的靶基因主要参与离子转运、乙酰胆碱激活的阳离子选择性通道活性、构成细胞质膜等功能;并参与TGF-β、肥厚性心肌病和黏附连接等通路。由70个点和70条边构成了TF-miRNA-mRNA互作网络,包含5个转录因子和63个mRNAs。结果表明,miR-148a-3p在小鼠脾组织中高表达且受到多种转录因子调控,与癌症发展密切相关。

SLC9A3-AS1调控miR-148a-3p/ROCK1信号轴影响肾癌细胞生物学功能

目的检测lncRNA SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)组织与肾癌细胞中的表达水平,探讨其促进肾癌细胞恶性生物学行为的机制。方法应用GEPIA2在线软件(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA数据库中SLC9A3-AS1在ccRCC组织中的表达水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLC9A3-AS1在不同肾癌细胞系、24例ccRCC组织与癌旁正常肾脏组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Transwell小室迁移实验检测敲低SLC9A3-AS1表达对肾癌细胞增殖与迁移的影响;应用蛋白质免疫印迹法检测增殖与迁移相关信号通路蛋白的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证SLC9A3-AS1与miR-148a-3p/ROCK1轴的靶向调控关系。结果GEPIA2软件分析结果显示,相较正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌组织中表达显著上调(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,相较癌旁正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在24例ccRCC组织中表达显著上调(P<0.01);相较永生化肾小管上皮细胞,SLC9A3-AS1在4种肾癌细胞系中表达均显著上调,以786-O细胞最为显著(P<0.01)。干扰SLC9A3-AS1表达,可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力,上调E-cadherin的蛋白表达水平,而下调N-cadherin、MMP2的蛋白表达水平(均P<0.05);过表达miR-148a-3p可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力(P<0.01)。双荧光素酶报告基因检测结果表明,SLC9A3-AS1可特异性结合miR-148a-3p,后者进一步靶向结合ROCK1 mRNA的3′UTR区域;过表达miR-148a-3p可明显下调ROCK1 mRNA的表达水平,敲低miR-148a-3p表达则产生相反的效应;敲低SLC9A3-AS1表达可显著下调786-O细胞中ROCK1 mRNA与蛋白的表达水平(P<0.01);下调miR-148a-3p表达可部分逆转SLC9A3-AS1沉默对786-O细胞增殖与迁移的抑制作用(P<0.05)。结论SLC9A3-AS1在ccRCC中通过调控miR-148a-3p/ROCK1轴发挥促癌作用,有望成为ccRCC的一个新的分子标志物。

基于miR-148a-3p/SMAD2轴探讨当归多糖对高糖诱导RGC凋亡的影响

目的探究当归多糖(APS)对高糖诱导视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响,及其基于微小RNA-148a-3p/Smad家族成员2(miR-148a-3p/SMAD2)轴的作用机制。方法将分别转染miR-148a-3p模拟物(mimics)、miR-148a-3p抑制剂(inhibitor)及其对照品mimics-NC、miR-NC的RGC,分为对照组(CG)、模型组(MG)、APS低剂量(APS-L)组、APS高剂量(APS-H)组、APS-H+miR-148a-3p对照品组(APS+miR-NC)、APS-H+miR-148a-3p抑制剂组(miR-148a-3p inhibitor),分别以相应的高糖和APS处理,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-148a-3p和SMAD2 mRNA表达水平,检测细胞活力、凋亡情况和氧化应激指标水平,Western Blot法检测SMAD2蛋白表达水平,双荧光素酶实验检测miR-148a-3p和SMAD2的靶向关系。结果(1)miR-148a-3p/SMAD2表达:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组中miR-148a-3p表达水平均高于MG组(t_(APS-L)=6.564、t_(APS-H)=10.542、t_(APS-H+miR-NC)=9.945,均P=0.000),SMAD2 mRNA表达水平低于MG组(t_(APS-L)=4.147,P=0.004;t_(APS-H)=6.464、t_(APS-H+miR-NC)=6.586,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组miR-148a-3p表达水平低于APS-H+miRNC组(t=7.558,P=0.000),SMAD2 mRNA表达高于APS-H+miR-NC组(t=4.513,P=0.001),差异均有统计学意义。(2)细胞活力和凋亡率:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组细胞活力高于MG组(t_(APS-L)=8.105、t_(APS-H)=11.509、t_(APS-H+miR-NC)=11.996,均P=0.000),细胞凋亡率低于MG组(t_(APS-L)=8.729、t_(APS-H)=15.690、t_(APS-H+miR-NC)=14.709,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组细胞活力低于APS-H+miR-NC组(t=10.212,P=0.000),细胞凋亡率高于APS-H+miR-NC组(t=12.247,P=0.000),差异均有统计学意义。(3)氧化应激:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)均低于MG组(LDH:t_(APS-L)=11.257、t_(APS-H)=18.770、t_(APS-H+miR-NC)=18.364,均P=0.000;MDA:t_(APS-L)=11.121、t_(APS-H)=17.139、t_(APS-H+miR-NC)=17.768,均P=0.000),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)均高于MG组(SOD:t_(APS-L)=9.408、t_(APS-H)=14.833、t_(APS-H+miR-NC)=13.240,均P=0.000;GSH:t_(APS-L)=5.616、t_(APS-H)=12.080、t_(APS-H+miR-NC)=12.642,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组LDH和MDA均高于APS-H+miR-NC组(t_(LDH)=15.121、t_(MDA)=14.613,均P=0.000),SOD和GSH均低于APS-H+miR-NC组(tSOD=12.278、tGSH=8.912,均P=0.000),差异均有统计学意义。。(4)凋亡蛋白:APS-L组、APS-H组和APS-H+miR-NC组SMAD2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)表达低于MG组(SMAD2:t_(APS-L)=4.565、t_(APS-H)=8.042、t_(APS-H+miR-NC)=7.390,均P=0.000;Bax:t_(APS-L)=4.916、t_(APS-H)=8.763、t_(APS-H+miR-NC)=8.336,均P=0.000;Caspase-3:t_(APS-L)=4.214、t_(APS-H)=10.201、t_(APS-H+miR-NC)=9.536,均P=0.000),B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达高于MG组(t_(APS-L)=3.713,P=0.001;t_(APS-H)=10.108、t_(APS-H+miR-NC)=10.314,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组SMAD2、Bax、Caspase-3表达均高于APS-H+miR-NC组(t_(SMAD2)=5.651、t_(Bax)=6.840、t_(Caspase-3)=8.205,均P=0.000),Bcl-2表达低于APS-H+miR-NC组(t=9.283,P=0.000),差异均有统计学意义。(5)靶向关系:miR-148a-3p与SMAD2的3'非翻译区存在结合位点。miR-148a-3p mimics和野生型SMAD2共转染组荧光素酶活性低于mimics-NC和野生型SMAD2共转染组,差异有统计学意义(t=12.781,P=0.000)。结论当归多糖可能通过上调miR-148a-3p、下调SMAD2,改善高糖诱导的RGC凋亡和氧化应激损伤。

乳腺癌患者血清微小RNA-135b、微小RNA-148a-3p、微小RNA-186-5p表达水平及其与新辅助化疗效果相关性研究

目的:探讨乳腺癌患者血清微小RNA-135b(miR-135b)、miR-148a-3p、miR-186-5p表达水平及其与新辅助化疗效果的相关性。方法:选取116例乳腺癌患者为病例组,均接受新辅助化疗,以21 d为1个周期,共化疗8个周期,根据化疗反应将患者分为耐药组(32例)和敏感组(84例),另选128例体检健康女性为对照组。比较病例组和对照组,耐药组和敏感组血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p表达水平。采用Pearson相关性分析血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p水平间的相关性。乳腺癌患者化疗效果的影响因素采用Logistic回归分析。血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p对乳腺癌患者化疗耐药的预测价值通过受试者工作特征(ROC)曲线分析。结果:与对照组比较,病例组miR-135b、miR-148a-3p水平升高,血清miR-186-5p水平降低(均P<0.05)。耐药组血清miR-135b、miR-148a-3p水平高于敏感组,血清miR-186-5p水平低于敏感组(均P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,血清miR-135b与miR-148a-3p呈正相关,与miR-186-5p呈负相关,血清miR-148a-3p与miR-186-5p呈负相关(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p是乳腺癌患者化疗效果的影响因素(均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p联合预测化疗耐药的曲线下面积(AUC)高于三者单独预测AUC(均P<0.05)。结论:乳腺癌患者血清miR-135b、miR-148a-3p水平呈高表达,血清miR-186-5p水平呈低表达,三者水平变化与新辅助化疗效果有关,且三者联合检测对患者新辅助化疗耐药的预测价值更高。

右美托咪定通过上调miR-148a-3p抑制焦亡改善老年大鼠术后认知功能障碍

目的 探索右美托咪定对老年大鼠术后认知功能障碍(POCD)的改善作用及其具体机制。方法 18月龄SPF雄性SD大鼠共98只,选取18只作为正常对照组,另80只使用七氟烷+肝叶切除手术建立POCD模型。模型建立成功后,随机分为模型组、模型+生理盐水组、模型+右美组、模型+右美+阿替美唑组,每组20只,探讨右美托咪定对各组老年大鼠POCD的作用。随后,从模型组和模型+右美组中各选取4只,给予miR-148a-3p模拟物或抑制剂,进一步研究右美托咪定改善POCD的机制。结果 七氟烷麻醉+肝叶切除手术导致了大鼠术后认知功能显著下降、神经炎症和焦亡发生增加、海马突触可塑性和miR-148a-3p表达降低(P<0.05);右美托咪定可改善术后认知功能以及上述病理变化(P<0.05);阿替美唑组可显著降低右美改善认知功能的效果(P<0.05);miR-148a-3p模拟物可模拟出右美托咪定对POCD的保护效果,并抑制焦亡,miR-148a-3p抑制剂则可降低右美托咪定的保护效果,并促进焦亡的发生(P<0.05);FMR1可能是miR-148a-3p的下游作用靶点。结论 右美托咪定在能够改善认知功能障碍的同时,还能够改善麻醉手术大鼠海马的突触可塑性、神经炎症,并可能通过上调miR-148a-3p表达抑制焦亡的发生,FMR1可能是miR-148a-3p的下游作用靶点。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

miR-148a-3p对软骨细胞炎性和凋亡的影响及其机制

目的研究miR-148a-3p对软骨细胞炎症因子、细胞凋亡和软骨细胞表型的影响。方法2周龄大耳兔处死后提取原代软骨细胞。为了探究炎症对软骨细胞相关标志物及其胞内miR-148a-3p表达水平的影响,建立IL-1β-诱导的OA细胞模型,软骨细胞分为control组和IL-1β组。为了探究miR-148a-3p对软骨细胞相关标志物及细胞凋亡相关因子表达水平的影响,软骨细胞分为blank组、IL-1β组、IL-1β+NC组、IL-1β+mimics组、IL-1β+inhibitor组。qRT-PCR检测IL-1β、SOX9、COL-Ⅱ、ACAN、MMP-13 mRNA水平;采用免疫蛋白印迹法检测软骨相关标志物MMP-13、COL-Ⅱ、ACAN、SOX9以及细胞凋亡相关因子Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达水平。采用ELISA法检测细胞上清中IL-6和IL-10的含量。结果①与control组比较,IL-1β组细胞MMP-13蛋白表达升高(P<0.05),COL-Ⅱ和ACAN蛋白表达降低(P<0.05);miR-148a-3p表达水平升高(P<0.0001);②与blank组比较,IL-1β组细胞上清液IL-6水平升高,IL-10水平降低(P<0.05);MMP-13 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),COL-Ⅱ和ACAN mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与IL-1β组比较,IL-1β+mimics组细胞上清液IL-6水平、MMP-13 mRNA和蛋白、Bax、Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);上清液IL-10水平、SOX9、COL-Ⅱ、ACAN mRNA和蛋白,以及Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。IL-1β+inhibitor组和IL-1β组间上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL-1β诱导体外软骨细胞中miR-148a-3p表达上调,可导致软骨细胞炎症性改变、细胞凋亡、软骨细胞表型改变和细胞外基质(ECM)降解。

miR-148a-3p调控EGFR抑制涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭和转移

目的:研究miR-148a-3p对涎腺腺样囊性癌SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移的影响及相关分子机制。方法:将miR-148a-3p模拟物和抑制剂,靶向EGFR的siRNA以及相应对照转染SACC-LM细胞。生物信息学手段分析预测miR-148a-3p的潜在靶基因;qRT-PCR检测miR-148a-3p和EGFR的mRNA表达;Western blot实验检测EGFR的蛋白表达。CCK-8、划痕和Transwell分别用于检测SACC-LM细胞的增殖、迁移和侵袭能力;双荧光素酶报告基因检测miR-148a-3p与EGFR之间的直接靶向关系;SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。结果:过表达或抑制miR-148a-3p可以显著抑制或促进SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移(P<0.05);生物信息学分析和双荧光素酶实验显示miR-148a-3p可靶向调控EGFR的表达(P<0.001);下调EGFR可以显著抑制SACC-LM细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),并可部分逆转miR-148a-3p抑制剂对这些能力的促进作用(P<0.05)。结论:涎腺腺样囊性癌细胞中miR-148a-3p的下调导致其靶基因EGFR的异常高表达,从而促进了涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭和转移。

miRNA-148a-3p对山羊卵巢颗粒细胞功能的影响

为探究miRNA-148a-3p在山羊卵巢颗粒细胞中的作用,通过过表达或抑制miRNA-148a-3p、qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、ELISA等方法,探究miR-148a-3p对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡、自噬及类固醇激素分泌的影响。结果发现,过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞增殖和PCNA表达,抑制miR-148a-3p显著抑制卵巢颗粒细胞增殖和PCNA表达。过表达miR-148a-3p抑制卵巢颗粒细胞凋亡,极显著下调细胞凋亡率,显著上调Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白比值,抑制miR-148a-3p促进卵巢颗粒细胞凋亡。过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞自噬,上调LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,抑制miR-148a-3p上调p62表达。过表达miR-148a-3p显著促进卵巢颗粒细胞孕酮分泌,并上调3β-HSD、StAR、CYP11A1的mRNA和蛋白表达。虽然抑制miR-148a-3p下调孕酮水平,但对3β-HSD、StAR、CYP11A1及CYP19A1的mRNA和蛋白表达无显著性影响。结果表明,miR-148a-3p可促进卵巢颗粒细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导自噬并刺激孕酮的合成。

血清miRNA-155-5p和miRNA-133a-3p表达对脓毒症心肌损伤的诊断价值

目的利用受试者工作特征曲线(ROC)评价血清miRNA-155-5p及miRNA-133a-3p表达对脓毒症心肌损伤的诊断价值.方法前瞻性收集江苏大学附属医院收治的脓毒症患者,根据心脏超声分为对照组(n=48例)和心肌损伤组(n=40例).检测88例脓毒症患者血清miRNA-155-5p及miRNA-133a-3p的表达量,采用ROC曲线评价血清miRNA-155-5p及miRNA-133a-3p对脓毒症心肌损伤的诊断价值.结果与对照组比较,脓毒症心肌损伤组患者的miRNA-155-5p[(2.02-±0.45)vs.(2.89-±0.37)]和miRNA-133a-3p[(1.93±0.37)vs.(2.42±0.22)]表达量均明显增高(P<0.05).ROC曲线分析提示,miRNA-155-5p(AUC=0.92,95%CI 0.86~0.97,P=0.028,敏感度97.50%,特异度72.92%)和miRNA-133a-3p(AUC=0.87,95%CI0.80~0.95,P=0.040,敏感度95.00%,特异度70.00%)对脓毒症患者心肌损伤有较高的诊断价值.结论血清miRNA-155-5p及miRNA-133a-3p的表达有助于诊断脓毒症心肌损伤.

HOTAIR与miRNA-148b-3p交互作用初步探究

目的:通过生物信息学分析结合双荧光素酶实验探讨HOTAIR与hsa-miR-148b-3p是否存在结合,为下一步探究两者调控机制提供方向。方法:本研究于TCGA数据库中下载高通量表达miRNA数据,根据cut-off标准(P<0.05,log2FC>2.0),乳腺肿瘤与正常标本共检测到112个有差异性表达的miRNAs。从miRcode数据库中筛选HOTAIR靶标miRNA,其中包括miRNA-148b-3p在内55种miRNA。将上诉两组数据通过Veen diagram鉴别出重叠基因即miR-148b-3p、miR-204-5p、miR-375。用Kaplan-Meier曲线和对数秩和检验对上述三种miRNA进行生存分析。结果表明miR-148b-3p、miR-204-5p对乳腺癌患者生存有明显影响,而miR-375无明显差异。进而在starBase数据库中注意到其中只有miRNA-148b-3p与HOTAIR的超保守区域显示出>10个碱基的互补性。最终双荧光素酶实验验证HOTAIR是否与hsa-miR-148b-3p结合。结果:通过Veen diagram对差异表达miRNAs和HOTAIR靶标miRNAs进行重叠数据筛选,然后进行生存分析,最终得出miR-148b-3p、miR-204-5p既在乳腺癌标本中有显著表达差异又对乳腺癌患者生存有明显影响,然而在starBase数据库中发现只有miRNA-148b-3p与HOTAIR结合。双荧光素酶实验表明HOTAIR与miR-148b-3p存在结合关系。结论:HOTAIR可能作为竞争性内源RNA(ceRNA)干扰miRNA-148b-3p对其靶基因的调控,从而影响乳腺癌的发生发展。

MiRNA-199a-3p通过mTOR通路与阿霉素联合抑制子宫内膜癌细胞的增殖和促凋亡作用

目的:探讨阿霉素对转染miRNA-199a-3p的子宫内膜癌(EC)的作用及机制。方法:构建pSIREN-miRNA-199a-3p过表达质粒并稳定转染内膜癌细胞系Ishikawa、SPEC-2细胞。应用逆转录PCR(RT-PCR)检测miRNA-199a-3p的表达;MTT、克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测mTOR信号通路相关蛋白表达。结果:上调miRNA-199a-3p可显著抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa、SPEC-2的克隆形成能力(P<0.01,P<0.05);miRNA-199a-3p可增强阿霉素对Ishikawa、SPEC-2细胞的生长抑制(P均<0.05)和凋亡诱导作用(P均<0.05);Western blot证实,miRNA-199a-3p可显著下调mTOR及其效应蛋白p70S6K的磷酸化水平。结论:miRNA-199a-3p可能通过mTOR通路与阿霉素联合抑制子宫内膜癌细胞的增殖并促进其凋亡,为联合应用miRNA和阿霉素治疗EC提供了实验依据。

miRNA-520a-3p调控MAP3K2表达对肺癌干细胞凋亡的影响

背景:有研究证实,miRNA-520a-3p在肺癌干细胞中有一定调节作用,但具体功能和作用机制尚不明确。目的:探索miRNA-520a-3p对肺癌干细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步研究。方法:采用免疫磁珠法从肺腺癌细胞株A549中分离出CD133^+肺癌干细胞。实时荧光定量PCR检测miRNA-520a-3p在CD133^+肺癌干细胞中的表达。采用脂质体转染法增加CD133^+肺癌干细胞中miRNA-520a-3p表达水平,流式细胞术检测过表达miRNA-520a-3p对CD133^+肺癌干细胞凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验检测miRNA-520a-3p对MAP3K2基因的调控作用。Western Blotting检测过表达miRNA-520a-3p对CD133^+肺癌干细胞中MAP3K2,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响。结果与结论:(1)在CD133^+肺癌干细胞中,miRNA-520a-3p表达水平显著低于CD133-肺癌细胞(P<0.05);(2)过表达miRNA-520a-3p后,显著增加了CD133^+肺癌干细胞凋亡百分比(P<0.05);(3)抑制miRNA-520a-3p表达能够显著增强含有MAP3K2基因3’-非翻译区(3’-UTR)报告质粒的荧光素酶活性(P<0.05),增加miRNA-520a-3p表达能够显著降低含有MAP3K2基因3’-UTR报告质粒的荧光素酶活性(P<0.05);(4)过表达miRNA-520a-3p后,CD133^+肺癌干细胞中MAP3K2,Bcl-2蛋白表达降低(P均<0.05),而Caspase-3蛋白表达增加(P<0.05);(5)结果表明,在CD133^+肺癌干细胞中,miRNA-520a-3p呈低表达状态。miRNA-520a-3p可能通过调控MAP3K2基因表达,诱导CD133^+肺癌干细胞凋亡。

miR-148a-3p通过抑制IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-148a-3p调控1型辅助性T(Th1)细胞极化调控的分子机制。方法分离6周龄小鼠的脾单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获得初始CD4+(naïveCD4+)Th细胞,用流式细胞术测定naïve CD4+Th细胞CD62L表达水平。用小鼠白细胞介素12(IL-12)和IL-2及抗小鼠IL-4,CD28和CD3ε单克隆抗体的混合因子体外诱导naïveCD4+Th细胞向Th1细胞极化,同时在诱导体系中加入miR-148a-3p模拟物,诱导72 h。流式细胞术检测干扰素γ(IFN-γ)和CD4双阳性(IFN-γ+CD4+)细胞百分比,实时荧光定量PCR检测Th1细胞极化相关基因IFN-γ、信号转导与转录激活因子1(STAT1)、IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))、IL-12Rβ_(2)、STAT4和T细胞介导的转录调节因子21(Tbx21)mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化关键转录因子STAT4和磷酸化STAT4(p⁃STAT4)蛋白表达水平。经生物信息学分析预测miR-148a-3p对IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路分子IL-12Rβ_(1),IL-12Rβ_(2),Tbx21和STAT4的调控靶标序列,用双荧光素酶载体psiCHECK2分别构建IL-12Rβ_(1),IL-12Rβ_(2),Tbx21和STAT4的3′UTR序列(psi-wt)及靶标点突变(psi-mutant)序列的克隆载体。将psi-wt和psi-mutant载体分别与miR-148a-3p模拟物共转染至人宫颈癌HeLa细胞,转染36 h后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。结果经免疫磁珠分选获得的naïveCD4+Th细胞高表达CD62L,表明naïveCD4+Th细胞分离成功;诱导后Th1细胞极化百分比为(71±5)%,miR-148a-3p模拟物转染后Th1细胞极化百分比下降至(61±3)%(P<0.05)。miR-148a-3p模拟物转染可下调Th1极化关键转录因子STAT1(P<0.01),Tbx21(P<0.01)和STAT4(P<0.01)mRNA表达水平,同时IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路的关键受体IL-12Rβ_(1)(P<0.05)和IL-12Rβ_(2)(P<0.01)及调控Th1极化关键细胞因子IFN-γ(P<0.01)mRNA表达水平亦显著下调。miR-148a-3p模拟物转染可显著下调Th1极化过程所必需的STAT4和p-STAT4蛋白表达水平。生物信息学预测miR-148a-3p靶标并用双荧光素酶报告载体构建含其psi-wt和psi-mutant序列的克隆载体;经双荧光素酶报告系统检测证实,miR-148a-3p可靶向下调IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路的多个关键分子STAT4(P<0.01),Tbx21(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和IL-12Rβ_(2)(P<0.01)表达。结论miR-148a-3p通过靶向抑制IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路中STAT4,Tbx21,IL-12Rβ_(1)和IL-12Rβ_(2)蛋白表达抑制Th1细胞极化。

丙戊酸钠通过激活miR-148a-3p/Mcl-1通路促进SH-SY5Y细胞凋亡

目的探讨抗癫痫药丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对神经细胞的凋亡诱导作用及相关机制。方法将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)用不同剂量VPA处理,流式分析细胞凋亡水平变化,Western blot检测Mcl-1蛋白水平变化,定量PCR分析Mcl-1 mRNA与miR-148a-3p水平变化,报告基因实验检测Mcl-1启动子活性变化。用miR-148a-3p抑制剂联合VPA处理细胞,观察miR-184a-3p在VPA下调Mcl-1表达中的作用及对VPA促SH-SY5Y细胞凋亡效果的影响。结果VPA可促进SH-SY5Y细胞凋亡,并抑制SH-SY5Y细胞中Mcl-1的蛋白和mRNA水平(P<0.05)。VPA处理不影响SH-SY5Y细胞中Mcl-1的启动子活性(P>0.05)。VPA可显著增强SH-SY5Y细胞中miR-148a-3p的表达(P<0.05),使用miR-148a-3p抑制剂可减轻VPA对Mcl-1表达的抑制作用,并减弱VPA的促细胞凋亡效果。结论VPA可能通过激活miR-148a-3p/Mcl-1信号通路促进SH-SY5Y细胞凋亡。

热性惊厥患儿血清miR-148a-3p HMGB125(OH)D水平与癫痫发作的相关性

目的探讨热性惊厥患儿血清微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、25-羟维生素D(25(OH)D)水平与癫痫发作的相关性。方法回顾性分析2018-01—2022-03南阳市中心医院收治的122例热性惊厥患儿,根据热性惊厥患儿预后结局是否发生癫痫,分为热性惊厥癫痫组36例和热性惊厥非癫痫组86例,同期选择55例未发生惊厥的呼吸道感染仅发热的患儿为对照组,比较3组患儿的血清miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D水平。收集3组患儿临床资料进行多因素Logistic回归分析,绘制ROC曲线分析miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D对热性惊厥患儿癫痫发作的预测价值。结果热性惊厥癫痫组的血清miR-148a-3p表达量、HMGB1水平高于热性惊厥非癫痫组、对照组[(2.26±0.57)vs(1.71±0.43)vs(1.50±0.38);(7.45±1.87)μg/L vs(6.70±1.58)μg/L vs(5.33±1.29)μg/L;均P<0.05],血清25(OH)D水平低于热性惊厥非癫痫组、对照组[(26.83±6.79)μg/L vs(34.24±8.56)μg/L vs(42.16±4.15)μg/L;P<0.05]。惊厥类型、惊厥持续时间、退热后脑电图结果、miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D与癫痫发作存在相关关系(P<0.05)。miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D预测热性惊厥患儿癫痫发作的灵敏度为83.33%、77.78%、72.22%,特异度为74.42%、68.60%、63.95%。结论血清miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D水平与热性惊厥患儿癫痫发作有一定相关性,可作为临床辅助诊断标志物。

血清miRNA-27a-3p、miRNA-210水平与ACI患者神经功能改善的关系

目的 探讨急性脑梗死(ACI)患者神经功能与miRNA-572和miRNA-218表达水平的关系。方法选择2020年5月至2020年11月在承德医学院附属医院神经内科就诊的ACI患者82例为ACI组,另选择同时期健康体检者82例作为对照组。采用RT-qPCR检测两组血清中miRNA-27a-3p和miRNA-210水平,全自动生化分析仪检测两组血清中TG、LDL-C和HDL-C的值,美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评价患者入院前神经功能缺损情况;改良Rankin量表(mRS量表)评价ACI患者预后情况。应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)评估各指标对ACI预后的预测价值,采用多因素Logistic回归分析探讨预后影响因素。结果两组年龄、性别、吸烟、糖尿病、冠心病、高血压、TG、LDL-C和HDL-C比较差异无统计学意义(均P> 0.05);与对照组比较,ACI组血清miRNA-27a-3p显著降低,miRNA-210显著升高(P<0.05);与轻度组比较,中度组和重度组ACI患者miRNA-27a-3p显著降低、miRNA-210显著升高(P<0.05);与中度组比较,重度组ACI患者血清miRNA-27a-3p显著降低、血清miRNA-210显著升高(P<0.05)。预后不良患者血清miRNA-27a-3p低表达率和miRNA-210高表达率显著高于预后良好患者(P <0.05);ROC曲线结果显示,miRNA-27a-3p和miRNA-210的曲线下面积分别为0.892和0.704,预测ACI预后的灵敏度分别为90.82%和74.5%,特异度分别为87.7%和71.6%。预后多因素Logistic回归分析显示,年龄> 65岁[OR及95%CI:2.21 (1.06~3.57)]、miRNA-27a-3p <3.13[OR及95%CI:4.17 (1.86~9.32)]、miRNA-210≥6.91[OR及95%CI:3.82 (1.84~7.94)]为ACI患者预后危险因素(P<0.05)。结论 miRNA-27a-3p表达降低、miRNA-210表达升高与ACI患者的神经功能缺损及预后不良密切相关,两者对ACI患者预后具有较高的预测价值,有望作为急性脑梗死临床有效生物标志物。

miRNA-193a-3p靶向TGF-β2基因诱导肝癌细胞凋亡的分子机制研究

目的探讨微小RNA(micro RNA,miRNA)-193a-3p在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞迁移、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测miR-193a-3p在肝癌及其癌旁正常组织中的表达;将miR-193a-3p mimic转染肝癌HepG2细胞系(NC为对照组),利用CCK-8(cell counting kit-8)实验、Transwell实验及流式细胞仪评估HepG2细胞的活性、迁移及凋亡情况;利用生物信息学分析、qRT-PCR及双荧光素酶报告实验确证miR-193a-3p对下游靶标转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2的影响;在miR-193a-3p过表达的HepG2细胞中转染TGF-β2质粒,检测过表达TGF-β2对miR-193a-3p诱导HepG2细胞活性、迁移及凋亡的影响。结果miR-193a-3p在肝癌组织中的表达显著低于正常肝脏组织,差异有统计学意义(P<0.01):与NC组比较,miR-193a-3p组细胞的增殖活性及迁移数量减少,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),且以时间依赖性方式诱导HepG2细胞凋亡:miR-193a-3p与靶基因TGF-β2的互补结合序列在进化上高度保守,TGF-β2是miR-193a-3p的下游靶标;与miR-193a-3p+空质粒组比较,miR-193a-3p+TGF-β2组肝癌细胞的增殖活性及迁移数量增多,细胞凋亡率显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-193a-3p在肝癌组织中表达减少,miR-193a-3p通过靶向调控TGF-β2基因抑制HepG2细胞的活性和迁移,促进HepG2细胞的凋亡。

下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p对外周血单核细胞的影响

目的探讨下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p对外周血单核细胞的影响。方法选取37例下肢动脉粥样硬化闭塞症(AS)患者外周血为AS组。另外选取同期37名健康体检者外周血为对照组。新鲜血管组织取自1例下肢AS患者截肢远端血管为实验组,以其截肢近端血管为对照。实时荧光定量PCR检测新鲜血管组织,分离得到的外周血中单核细胞和微泡中miRNA-199a-3p表达水平。以人单核细胞TTHP-1为载体,miRNA-199a-3p mimics组和miRNA-199a-3p inhibitor组分别转染miRNA-199a-3p mimics和miRNA-199a-3p inhibitor,同时设置空白对照组。实时荧光定量PCR检测各组miRNA-199a-3p、趋化因子单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)和Fractalkine表达水平。结果下肢动脉粥样硬化斑块内miRNA-199a-3p表达水平显著高于正常组织(P<0.05)。AS组外周血单核细胞和微泡中miRNA-199a-3p表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。与空白对照组相比,miRNA-199a-3p mimics组miRNA-199a-3p表达水平显著上升(P<0.05),miRNA-199a-3p inhibitor组miRNA-199a-3p表达水平显著下降(P<0.05)。与空白对照组相比,miRNA-199a-3p mimics组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),miRNA-199a-3p inhibitor组MCP-1、RANTES和Fractalkine的mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。结论动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞高表达miRNA-199a-3p,并以微泡形式分泌到外周血中,抑制单核细胞中MCP-1、RANTES和Fractalkine等趋化因子的表达,是一种动脉粥样硬化保护因素。