miRNA-296在胃黏膜癌前病变中的表达及临床意义

目的探讨miRNA-296的成熟体miR-296-5p和miR-296-3p在胃黏膜癌前病变中的表达及胆汁酸对其的调控作用。方法根据病理学检查结果,将182例患者石蜡包埋胃组织样本制成的组织芯片分为4组:慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)组、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)组、肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)组、异型增生(dysplasia,Dys)组。用原位杂交的方法检测各组miR-296-5p和miR-296-3p的表达。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测鹅去氧胆酸(CDCA)刺激人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞后miR-296-5p和miR-296-3p的表达水平。结果miR-296-5p/3p在CSG与CAG组织中的表达无统计学差异,而在IM、Dys组织中的表达均明显降低。经CDCA刺激人胃黏膜上皮细胞株GES-1细胞后,miR-296-5p和miR-296-3p的表达水平明显降低。结论miR-296-5p/3p在IM及Dys病变组织中表达明显低于CSG中表达,胆汁酸抑制胃上皮细胞表达miR-296,这可能是胆汁酸诱导胃黏膜发生癌变的机制。

miRNA-296表达水平与NSCLC患者临床病理特征及预后的关系

目的分析miRNA-296在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达和对临床预后的影响。方法收集120例NSCLC患者的临床随访资料,提取并检测miRNA-296在肺癌血清的表达,采用K-M法和Cox回归性和定量分析miRN-296与NSCLC患者临床预后的关系。结果 miRNA-296的表达与年龄、性别、吸烟史、组织类型和肿瘤大小不相关(P> 0. 05);与分化程度(P=0. 004)、临床分期(P=0. 025)和淋巴结转移(P=0. 020)有关。K-M分析结果显示miRNA-296高表达和低表达生存曲线有明显差异(P=0. 011);多因素Cox回归分析显示,淋巴结转移和miRNA-296高表达仍是NSCLC患者不良预后的独立预测因子(HR=1. 89,95%CI:1. 07-3. 99,P=0. 031; HR=1. 85,95%CI:1. 13-2. 50,P=0. 021)。结论 miRNA-296高表达是NSCLC病人不良预后的独立预测因子,可能是其治疗的新的靶点。

miRNA-296-5p靶向BOX抑制胃癌细胞的凋亡

目的分析miRNA-296-5p在癌旁组织和肿瘤组织中的表达差异,并研究miRNA-296-5p抑制胃癌细胞凋亡的机制。方法采用实时荧光定量PCR检测5例胃癌患者胃癌组织和相应的癌旁组织中的miRNA-296-5p的表达水平;应用miRNA-296-5p mimic、miRNA-296-5p inhibitor和阴性对照分别转染BGC-823和MGC-803细胞,通过CCK-8检测细胞的增殖水平,通过流式细胞术检测细胞凋亡水平;采用蛋白印迹技术检测BOK蛋白表达水平;采用双荧光素酶实验验证miRNA-296-5p和BOX之间的关系。结果与癌旁组织相比,miRNA-296-5p在胃癌组织中明显升高(t=-6.37,P<0.05),且与BOK蛋白表达呈负相关。miRNA-296-5p过表达之后,明显抑制MGC-803和BGC-823细胞凋亡;miRNA-296-5p表达下降之后,MGC-803和BGC-823细胞的凋亡水平明显升高。实时荧光定量PCR和Western-blot结果表明miRNA-296-5p过表达之后,BOK蛋白的表达水平明显降低,而miRNA-296-5p被抑制之后,BOK蛋白的表达水平明显升高。双荧光素酶报告实验显示,miRNA-296-5p靶向BOK的miRNA的3’非编码区。结论相较于癌旁组织,miRNA-296-5p在胃癌组织中高表达,通过抑制BOK的蛋白水平实现促进胃癌进展,从而降低胃癌细胞的凋亡水平。

miRNA-296-5p介导PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制神经细胞SK-N-SH中EV71病毒复制的作用机制

目的探讨miRNA-296-5p介导第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物/磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸蛋白激酶(PTEN/PI3K/AKT)信号通路发挥抑制神经细胞SK-N-SH中肠道病毒71型(EV71)病毒复制的作用机制。方法收集临床EV71病毒感染手足口病患儿及正常体检儿的血清样本,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组儿童血清炎症因子降钙素原(PCT)、CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-13的表达变化。取对数生长期经EV71病毒感染的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,设置对照组、miRNA-296-5p mimic组和miRNA-296-5p inhibitor组,根据Lipofectamine■2000■细胞转染试剂进行转染。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法观察三组细胞中EV71-VP1病毒基因mRNA和蛋白以及PTEN/PI3K/AKT信号通路相关分子表达。结果ELISA检测结果表明EV71病毒感染手足口病患儿血清炎症因子PCT、CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-13的水平明显高于正常体检儿(P<0.05)。qRT-RCR和Western blot结果显示EV71病毒感染后神经细胞SK-N-SH中miRNA-296-5p和PTEN的mRNA和蛋白水平明显降低,而EV71-VP1和PTEN/PI3K/AKT信号通路相关分子的mRNA和蛋白水平明显升高(P<0.05);miRNA-296-5p mimic组中PTEN表达明显升高,同时抑制EV71-VP1的表达和PI3K/AKT信号通路的活化,而miRNA-296-5p inhibitor组可逆转上述作用(P<0.05)。结论miRNA-296-5p通过靶向PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制神经细胞SK-N-SH中EV71病毒的复制,同时降低细胞炎症反应,靶向miRNA-296-5p及其下游PTEN/PI3K/AKT信号通路有望为临床EV71病毒导致的手足口病治疗提供可行的治疗靶点。

miRNA-296对人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞侵袭能力影响的体外实验研究

目的探讨微小RNA（miRNA-296）对人类风湿关节炎（RA）滑膜成纤维细胞MH7A的影响及机制。方法将miRNA-296抑制物转染人人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A细胞株后，采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力变化；实时定量荧光聚合酶链反应（Real-timePCR）检测转染miRNA-296抑制物前后Janus激酶2（JAK2）、信号转导子和转录激活子3（STAT3）、瘦素的mRNA表达变化；Westernblot技术分析miRNA-296抑制物对MH7A细胞中JAK2、STA33、瘦素蛋白的表达影响。结果miRNA-296抑制物对MH7A细胞侵袭有明显的抑制作用。下调miRNA-296能够抑制MH7A细胞中JAK2、STAT3mRNA和蛋白的表达、提高瘦素mRNA和蛋白的表达。结论低表达miRNA-296可以显著抑制人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A的侵袭能力，这可能与JAK2／STAT3／瘦素信号通路有关。

MiR-296-5p在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的:检测弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)细胞中micro RNA-296-5P(mi RNA-296-5p)的表达水平,并研究干扰mi RNA-296-5p的表达对DLBCL细胞株DB的增殖、迁移及凋亡的影响。方法:应用人淋巴细胞分离液提取健康人外周血单个核细胞,实时荧光定量PCR检测单个核细胞与DLBCL-DB细胞mi RNA-296-5p的表达。利用mi RNA-296-5p inhibitor干扰DB细胞mi RNA-296-5p的表达,实时荧光定量PCR检测转染后mi RNA-296-5p的表达,并进一步用CCK-8法、Transwell法和Annexin V-FITC/PI双染法检测转染后细胞增殖、迁移和凋亡的变化。结果:mi RNA-296-5p在DLBCL细胞株DB中明显高表达,转染mi RNA-296-5p inhibitor后细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制,而细胞凋亡没有明显改变。结论:mi RNA-296-5p的高表达可能与DLBCL的发生发展有关,可能成为DLBCL的预后评估指标之一。

缺氧诱导因子1α通过调控miRNA‑296‑5p影响缺氧诱导的胰腺癌细胞迁移、侵袭

目的探讨miRNA‑296‑5p(miR‑296‑5p)对缺氧诱导的胰腺癌细胞迁移、侵袭的影响及其相关机制。方法选择人胰腺癌细胞株PANC‑1;收集上海市奉贤区中心医院和蚌埠医学院附属第一医院2010年1月至2014年12月55例胰腺癌患者手术切除的胰腺癌组织和10例癌旁正常胰腺组织。采用免疫组织化学及原位杂交法检测胰腺癌及癌旁正常胰腺组织芯片中缺氧诱导因子1α(HIF‑1α)、miR‑296‑5p的表达水平,分析二者的相关性及其与患者临床病理特征的关系。PANC‑1细胞分为缺氧组和常氧组,采用Transwell法测定两组细胞迁移与侵袭能力,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT‑PCR)检测两组细胞miR‑296‑5p及HIF‑1αmRNA表达。转染小干扰RNA(siRNA)干扰HIF‑1α的表达,将细胞分为PANC‑1组(空白对照)、PANC‑1‑NC组(阴性对照)、PANC‑1‑siRNA组,检测miR‑296‑5p的表达;同时转染miR‑296‑5p激动剂和抑制剂,分为Agomir‑miR‑296‑5p组(激动剂组)、Agomir‑miR‑296‑5p‑NC组(激动剂阴性对照组)、Antagomir‑miR‑296‑5p组(抑制剂组)、Antagomir‑miR‑296‑5p‑NC组(抑制剂阴性对照组);Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力。采用荧光素酶报告基因系统验证miR‑296‑5p启动子区是否存在HIF‑1α的结合位点。结果胰腺癌组织HIF‑1α高表达率高于癌旁正常胰腺组织[81.8%(45/55)比0(0/10),P<0.01];胰腺癌组织miR‑296‑5p高表达率低于癌旁正常胰腺组织[12.7%(7/55)比90.0%(9/10),χ^(2)=27.23,P<0.01]。HIF‑1α表达和miR‑296‑5p表达呈负相关(r=-0.53,P<0.01);miR‑296‑5p低表达与肿瘤长径、TNM分期、淋巴结转移均有关(均P<0.05)。常氧组PANC‑1侵袭细胞数为(15.3±2.1)个,缺氧组为(24.7±1.5)个,差异有统计学意义(t=0.26,P=0.003);常氧组PANC‑1迁移细胞数为(20.7±3.8)个,缺氧组为(32.7±1.2)个,差异有统计学意义(t=5.25,P=0.006)。常氧组PANC‑1细胞HIF‑1αmRNA相对表达量为0.30±0.02,缺氧组为1.00±0.01,差异有统计学意义(t=56.45,P<0.01);常氧组PANC‑1细胞miR‑296‑5p相对表达量为3.05±0.20,缺氧组为1.14±0.04,差异有统计学意义(t=16.05,P<0.01)。PANC‑1组、PANC‑1‑NC组、PANC‑1‑siRNA组侵袭细胞数分别为(24.7±1.5)个、(25.7±1.5)个、(12.0±1.7)个,差异有统计学意义(F=68.13,P<0.01),PANC‑1‑siRNA组较PANC‑1组细胞侵袭能力下降(t=9.50,P=0.001);迁移细胞数分别为(32.7±1.2)个、(37.0±1.0)个、(17.3±1.2)个,差异有统计学意义(F=262.09,P<0.01),PANC‑1‑siRNA组较PANC‑1组细胞迁移能力下降(t=16.26,P<0.01)。Antagomir‑miR‑296‑5p组与PANC‑1组比较,细胞侵袭和迁移能力增强(均P<0.05);Agomir‑miR‑296‑5p组与PANC‑1组比较,细胞侵袭和迁移能力减弱(均P<0.05)。荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性结果显示,miR‑296‑5p存在与HIF‑1α结合的靶点。结论HIF‑1α通过负向调控miR‑296‑5p在缺氧诱导的胰腺癌细胞的侵袭、迁移中发挥重要作用。