miRNA-326及N-ras基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的研究

目的探讨儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓中miRNA-326的表达及其临床意义。研究N-ras基因在儿童ALL微小残留病(MRD)中的表达,以期为儿童ALL的复发提供生物学检测标志。方法本研究选取35例儿童ALL和35例非白血病儿童作为对照组,通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测miRNA-326在儿童ALL中相对表达量,使用单链构象多态性PCR(PCR-SSCP)检测N-ras基因在治疗1年后的微小残留病(MRD)中的变化。结果miRNA-326在儿童ALL中的相对表达量(2.22±0.72)较对照组(6.35±1.23)明显下降;SSCP的电泳结果显示MRD组患者N-ras基因的电泳速度较对照组快,基因突变率为44.44%。结论miRNA-326和N-ras基因的检测可作为儿童ALL的诊断及复发生物学标志,也可为白血病的耐药性监测和治疗提供新的靶点。

MiRNA-326抑制人椎间盘退变髓核细胞活力和凋亡的机制

目的:探讨过表达miRNA-326对椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)髓核(nucleus pulposus,NP)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:构建miRNA-326慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miRNA-326-NP,同时设置空载体GV369-NP组与空白组。荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白[绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]的表达,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测miRNA-326的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miRNA-326与FasL的靶向关系,蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD,caspase-3,Bcl-2及Bax的表达,使用试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况。结果:荧光显微镜下示,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组未见绿色荧光。与空白组相比,GV369-miRNA-326-NP组中miRNA-326的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率,FADD,caspase-3和Bax的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);GV369-NP组与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miRNA-326与FasL存在靶向关系。结论:MiRNA-326可抑制IDD NP细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用。

miRNA-326作用于其靶基因BCL-XL的研究

目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体,设置对照组,转染细胞检测相对荧光强度。结果分别构建了PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体;miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染组)(P=0.034);同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组(P=0.022)。结论miRNA-326作用于BCL-XL基因的3′UTR;这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。