miRNA-34c实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立稳定有效检测miR-34c的实时荧光定量技术体系,采用茎环结构法设计了反转录引物,并通过梯度浓度及梯度温度PCR法对miR-34c的最佳退火延伸温度和模板浓度进行了确定,最后通过实时荧光定量PCR对miR-34c进行检测。试验成功建立了精确检测miR-34c的实时荧光定量技术体系,其中miR-34c最佳退火延伸温度为62.4℃及每个实时定量反应体系中cDNA对应的RNA量最适浓度为50ng/μL,并得到重复性高、特异性强的检测结果。该技术体系的建立不仅为检测miR-34c提供了精准便捷的方法,而且可为设计检测其他miRNA提供技术支持。

宫颈癌组织中miRNA-34c的表达水平分析及其靶基因PLK4的鉴定

目的:分析miRNA-34c在宫颈癌组织中的表达水平并鉴定其新的靶基因。方法:利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)检测甘肃省妇幼保健医院34例宫颈癌和癌旁正常组织中miRNA-34c表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库预测miRNA-34c新的靶基因Polo样激酶4(PLK4)。将含有PLK4的3‘UTR片段荧光素酶载体分别与miRNA-34c模拟物或阴性对照共转染HEK293T细胞,并检测其荧光素酶活性。在人宫颈癌细胞Si Ha细胞中分别转染miRNA-34c模拟物或阴性对照,利用q RT-PCR法和Western blot法分别检测靶基因的m RNA和蛋白质的表达水平。结果:与癌旁正常组织相比,miRNA-34c在宫颈癌组织中表达下调。在HEK293T细胞中,miRNA-34c模拟物显著抑制荧光素酶的活性(P<0.01)。miRNA-34c模拟物显著下调Si Ha细胞中PLK4的m RNA和蛋白质的表达(P<0.01)。结论:miRNA-34c在人宫颈癌组织中表达下调,且能与PLK4的3’UTR结合并下调其m RNA和蛋白质的表达。

miRNA-34c在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的检测miRNA-34c在鼻咽癌组织中的表达情况,并探讨其在鼻咽癌发生、发展中的意义。方法以实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测28例鼻咽癌石蜡包埋组织中相对于28例鼻咽部慢性炎症石蜡包埋组织中miRNA-34c的差异表达情况,并结合临床资料及随访结果分析miRNA-34c与鼻咽癌病例临床因素的相关性。结果鼻咽癌组织中miRNA-34c的相对表达量明显低于鼻咽部慢性炎症组织,差异有统计学意义(P<0.05)。且随着临床分期的增高、淋巴结转移,miRNA-34c的表达呈下降趋势。结论 miRNA-34c可能参与鼻咽癌的发生与发展,调控miRNA-34c的表达量有望为鼻咽癌的治疗提供一种新的思路或方法。

皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。

miRNA-34c对肺腺癌A549细胞的辐射增敏效应

目的研究肺腺癌A549细胞中miRNA-34c的辐射增敏效应。方法单独转染miRNA-34c序列或单独照射或转染和照射联合处理细胞后,采用MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,藻红B染色法观察细胞凋亡率,Western blot检测p53蛋白的表达。结果转染联合照射处理组的抑制率及凋亡率都较单独转染或单独照射组明显增高(均P<0.05),且随miR-34c转染浓度的增加而增高(均P<0.05)。细胞周期检测结果显示,细胞明显阻滞于G1/G0期(P<0.05)。联合处理的细胞p53蛋白表达量较单独照射组增加,且呈miRNA-34c浓度依赖性增加(P<0.05)。结论 miRNA-34c对肺腺癌细胞A549有辐射增敏效应,可强化p53蛋白的表达,诱导细胞G1/G0期阻滞和凋亡。

粪便SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化检测在大肠肿瘤筛查中的临床应用

目的评估检测大肠肿瘤患者粪便中SEPT-9和微RNA(miRNA)-34b/c基因甲基化对大肠肿瘤筛查的临床性能。方法采用病例对照研究方法,使用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法检测大肠肿瘤患者(大肠癌组35例、大肠腺瘤组47例)和正常对照人群(正常对照组52名)粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因是否存在甲基化,来评估其筛查大肠肿瘤的性能。结果大肠癌组SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率分别为68.6%、71.4%,大肠腺瘤组分别为57.4%、63.8%,正常对照组分别为9.6%、11.5%。3组的SEPT-9、miRNA-34b/c基因甲基化阳性率比较差异均有统计学意义(χ^(2)_(SEPT-9)=37.185,χ^(2)_(miRNA-34b/c)=40.040,P均<0.001),利用Bonferroni法进行两两比较,大肠癌组和大肠腺瘤组的甲基化阳性率比较差异无统计学意义,两者与正常对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.001)。3组联合检测SEPT-9和miRNA-34b/c基因的甲基化阳性率为88.6%、76.6%、13.5%,大肠癌组和大肠腺瘤组联合检测的甲基化阳性率均高于SEPT-9单基因检测和miRNA-34b/c单基因检测(P均<0.05)。结论检测粪便中SEPT-9和miRNA-34b/c基因甲基化具有效好的大肠肿瘤筛查性能,或许可作为大规模人群筛查大肠肿瘤新的生物标志物组合;多基因甲基化联合检测筛查的性能优于单基因。

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用

microRNA(miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8(Stra8)在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。

miR-34c介导的辐射旁效应对心肌成纤维细胞的影响及黄芪甲苷的防护

目的:探讨miR-34c/Notch1介导的辐射旁效应对心肌成纤维细胞(CFs)的影响和黄芪甲苷的干预效应。方法:将miR-34c inhibitor和miR-34c inhibitor NC转染至CFs中分别构建(miR-34c-inhibitor)-CFs和(miR-34c-inhibitor NC)-CFs,用黄芪甲苷5.1μmol/L预先2 h处理CFs构建黄芪甲苷-CFs,以2 Gy X线照射,并与正常CFs共培养48 h建立辐射旁效应体系。试验分为:正常对照组、模型对照组、miR-34c-inhibitor NC组、miR-34c-inhibitor组、黄芪甲苷5.1μmol/L组;以qRT-PCR、Western blot、流式细胞术、CCK-8法、划痕实验法等检测分析旁效应CFs中miR-34c和Notch1分子的表达、CFs转分化和致纤维化能力的变化。结果:与照射前相比,照射后CFs中miR-34c表达逐渐上调,24 h时最高(P<0.01),而旁效应CFs中miR-34c的表达也随之上调,48 h达高峰(P<0.01)。与正常对照组相比,模型对照组旁效应CFs中miR-34c表达显著上调,Notch1蛋白表达显著下调,α-SMA表达和α-SMA阳性细胞比例显著增加,CFs增殖活性和迁移率显著升高、TGF-β1和ColⅠ蛋白及mRNA表达上调(P<0.01);与模型对照组相比,miR-34c-inhibitor组和黄芪甲苷5.1μmol/L组中旁效应细胞miR-34c和Notch1的差异表达被逆转,旁效应CFs的α-SMA表达、α-SMA阳性细胞比例和细胞增殖、迁移率均显著降低,TGF-β1和ColⅠ蛋白及mRNA表达显著下调(P<0.01)。结论:X线诱导CFs中miR-34c表达上调,并上调旁效应CFs的miR-34c,进而通过负性调控Notch1信号通路,促进旁效应CFs转分化,增强其致纤维化能力;而黄芪甲苷通过调控miR-34c/Notch1介导的辐射旁效应对CFs的转分化和促纤维化具有抑制效应,从而发挥防护放射性心脏纤维化损伤的作用。

非小细胞肺癌组织miRNA-34b/c甲基化及预后相关性

目的探讨miRNA-34b/c在可手术的非小细胞肺癌组织中的甲基化及其与预后的相关性。方法回顾性分析中国医科大学附属盛京医院2009年12月-2015年12月期间行手术治疗的53例非小细胞肺癌患者的临床资料。采用定量RT-PCR检测上述病例肺癌标本中miRNA-34b/c的甲基化水平,应用Kaplan-Meier方法进行单因素生存曲线分析miRNA-34b/c甲基化水平与非小细胞肺癌生存的相关性,Log-rank法进行检验,采用Cox风险比例模型分析预后的独立影响因素。结果非小细胞肺癌miRNA-34b/c甲基化水平较高,生存分析显示miRNA-34b/c甲基化组生存期明显低于非甲基化组(P<0.01),Cox风险比例模型分析显示miRNA-34b/c甲基化可作为非小细胞肺癌患者预后的独立影响因素。结论非小细胞肺癌miRNA-34b/c甲基化水平高,miRNA-34b/c甲基化提示非小细胞肺癌患者预后不良。

鼻咽癌石蜡标本中筛选差异表达的miRNA

目的应用MicroRNAs(miRNAs)芯片技术筛选鼻咽癌石蜡标本组织中差异表达的miRNAs,研究与鼻咽癌相关的miRNAs。方法从2例鼻咽癌石蜡切片和相配对的正常鼻组织中提取总RNA,miRNA芯片检测miRNA表达情况,然后在37例鼻咽癌石蜡切片和正常鼻组织中,用Real-time RT-PCR(Taqman)对部分差异表达miRNA进行验证。结果芯片结果显示:与配对的正常鼻组织相比,有24个miRNAs在鼻咽癌中异常表达,其中8个miRNA高表达,16个miRNA低表达。用Real-time RT-PCR(Taqman)验证显示,hsa-miR-205在鼻咽癌中表达水平升高(P=0.021);hsa-miR-34c在鼻咽癌组织中表达水平降低(P=0.019)。结论 hsa-miR-205和hsa-miR-34c可能参与了鼻咽癌的发生过程。

香猪睾丸2种miRNA在不同生长发育阶段的变化

旨在研究贵州从江香猪睾丸组织miRNA-34c和miRNA-221的表达变化,探讨其对睾丸发育的调节作用.用实时荧光定量PCR法检测1～4和18月龄香猪睾丸组织中miRNA-34c和miRNA-221的表达量变化,应用生物信息学软件推测miRNA-34c和miRNA-221的靶基因和信号转导通路.结果：miRNA-34c从2月龄开始表达量上升,3月龄达到峰值,之后下降.推测miRNA-34c的靶基因有594个,涉及细胞过程、代谢调节、转录调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、细胞增殖正调控及繁殖等过程.miRNA-221的预测靶基因有429个,与细胞凋亡、转录调控、繁殖过程、发育等有关.miRNA-34c信号转导通路显著富集于pre-NOTCH转录和翻译信号通路、pre-NOTCG表达和生物学过程、NOTCH信号通路、生物发育通路,轴突传导、L1 CAM作用信号等.miRNA-221靶基因的信号通路集中在细胞凋亡、ErbB和Ras信号通路等.本研究结果提示,miRNA-34c和miRNA-221参与香猪睾丸发育的调节。