miRNA-548m调控SUMO1基因表达在胎儿唇腭裂的病因学研究

目的对1例超声显示唇腭裂胎儿进行遗传学检测,分析胎儿唇腭裂的遗传学病因。方法应用单核苷酸多态性微阵列技术(single nucleotide polymorphism array,SNP array)对引产胎儿皮肤标本进行基因组拷贝数变异检测,并分析变异区域基因致病性。结果SNP array检测显示唇腭裂胎儿基因组Xq21.31-q22.1(91063807-100293555)区域存在约9.23 Mb半合子缺失,其表型正常母亲该区域杂合缺失,该变异区域包括13个OMIM基因和1个非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)基因MIR548M,在人口腔上皮细胞系中抑制MIR548M编码的miRNA-548m后,唇腭裂相关基因SUMO1表达上调。结论抑制miRNA-548m导致唇腭裂相关基因SUMO1表达异常,SNP array检测发现的MIR548M基因缺失可能是导致胎儿发生唇腭裂的关键遗传学病因。

FDCs-miR-548m-CDK6轴在套细胞淋巴瘤集落形成中的研究

目的:探讨FDCs-miR-548m-CDK6轴在套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)集落形成中的作用。方法:分别采用RT-qPCR和Western blot检测MCL细胞与滤泡树突状细胞(FDCs)共培养后miR-548m和CDK6的变化。以生物信息学软件预测miR-548m的靶点,Western Blot检测MCL细胞系分别转染pre-miR-548m和anti-miR-548后细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)的变化。荧光素酶报告基因实验验证CDK6是否为miR-548m的直接作用靶点。MCL细胞系与/不与FDCs共培养,过表达miR-548m或者敲低CDK6后MCL的集落形成能力。结果:FDCs与MCL的粘附作用可以下调miR-548m并上调CDK6。生物信息学软件预测显示CDK6的3'UTR是miR-548m的潜在靶点,且过表达miR-548m能够减少CDK6的表达,抑制miR-548m表达能够增加CDK6。荧光素酶报告基因实验证实CDK6的3'UTR是miR-548m的一个直接作用靶点。集落形成实验显示过表达miR-548m或者敲低CDK6后,细胞的集落形成能力明显减弱。结论:FDCs通过抑制MCL中miR-548m表达上调CDK6,增强MCL的集落形成能力。

miRNA-21对乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其机制

目的:观察miRNA-21对乳腺癌细胞放射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法:乳腺癌T47D和MDA-MB-361细胞分别给予0.0、2.5和5.0 Gy γ射线照射,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术分析细胞周期进程,实时定量PCR法检测72 h内细胞中miRNA-21表达水平。T47D和MDA-MB-361细胞分别转染anti-miRNA-21序列(anti-miRNA-21组)和阴性对照序列(阴性对照组),并设置未转染细胞为空白对照组,实时定量PCR法检测各组细胞中miRNA-21表达水平;经0.0和5.0 Gy γ射线照射后,CCK8法检测细胞存活率,流式细胞术分析细胞周期进程。结果:经5.0 Gy γ射线照射后,T47D细胞存活率明显高于MDA-MB-361细胞(P<0.05);与0.0 Gy照射组比较,5.0 Gy 照射组T47D和MDA-MB-361细胞G 2/M期细胞百分率均明显升高(P<0.05),miRNA-21表达水平均明显升高(P<0.05)。与空白对照组比较,anti-miRNA-21组T47D和MDA-MB-361细胞中miRNA-21表达水平均明显降低(P<0.05或 P<0.01);给予5.0 Gy γ射线照射后,anti-miRNA-21组T47D和MDA-MB-361细胞存活率均明显降低(P<0.05或 P<0.01),T47D细胞G 2/M期细胞百分率明显降低(P<0.05),而sub G 1期细胞百分率明显升高(P<0.05)。结论: miRNA-21表达下调能够增强乳腺癌细胞的放射敏感性,其机制可能与抑制细胞周期G 2/M期阻滞有关。

miRNA-330-3p/Ap2m1轴在过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体抗心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌外泌体(BMSC^(GATA-4)exosome)通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴减少心肌细胞凋亡,提高心肌梗死心功能。方法建立小鼠心梗模型,共分7组,分别经尾静脉注射BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome、BMSC^(miRNA-330-3p-inhibitor)-exosome、BMSC^(空载体)-exosome、BMSCexosome 48 h,同时将心梗未处理组及正常小鼠作为对照组。采用心脏彩超检测各组心功能,RT-PCR检测心梗心肌细胞内miRNA-330-3p的表达,Tunel法检测各组心梗心肌细胞凋亡数量。miRNA-330-3p对应靶基因Ap2.m1、Cnot4蛋白采用Western blot法进行检测。结果BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心功能改善最为明显(P<0.05),其心肌细胞内miRNA-330-3p表达量最高(P<0.05)。BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心肌细胞的凋亡率最低(P<0.05),BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心肌细胞内的Ap2.m1的表达最低(P<0.05)。结论过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞外泌体通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴抗心肌细胞凋亡。

长链非编码RNA M通过作为miRNA-1的中心诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移

目的:探究LncRNA M是否可以通过作为miRNA-1的中心来诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移。方法:将体外培养的VSMC按照各检测指标需要进行转染,通过生物信息学找到可以与LncRNA M结合的miRNA-1;通过双荧光素酶报告基因检测各组的荧光素酶活性;RT-PCR检测LncRNA M与miRNA-1之间的调控关系,并用流式细胞仪检测细胞周期变化,从而找出LncRNA M及miRNA-1对细胞增殖的影响;通过MTT实验和Transwell实验分别检测细胞的增殖、迁移情况。结果:通过生物信息学及双荧光素酶报告基因检测得出LncRNA M可能是miRNA-1的一个靶向调控基因,并且miRNA-1能够和LncRNA M结合从而调控其在VSMC中的表达;RT-PCR和流式细胞术研究发现,敲低LncRNA M可能通过上调miRNA-1的表达来促进VSMC细胞的增殖。通过MTT实验和Transwell实验发现,与对照组相比miRNA-1 mimics组、miRNA-1 mimics+pmirGLO组的细胞活力和迁移率明显上升(P<0.05),过表达LncRNA M后其细胞活力和细胞迁移率明显下降(P<0.05)。结论:LncRNA M可能通过作为miRNA-1的中心上调miRNA-1的表达诱导VSMC的增殖和迁移。

miRNA-19基因表达与大脑中动脉M1段狭窄程度及斑块易损性的相关性

目的分析miRNA-19a、miRNA-19b-1与大脑中动脉M1段狭窄程度及斑块易损性的相关性。方法选取大脑中动脉M1段狭窄患者(病例组)和正常者(对照组)各80例;根据动脉狭窄程度将患者分为轻度组、中度组和重度组;根据斑块易损性将患者分为高危组、中危组和低危组。采用qPCR检测各组血清miRNA-19a、miRNA-19b-1的表达水平,受试者工作特征曲线分析二者预测高危斑块的价值,计算曲线下面积(AUC)。结果血清miRNA-19a和miRNA-19b-1水平比较:病例组高于对照组;重度组高于轻度和中度组,中度组高于轻度组;高危组高于低危组和中危组,中危组高于低危组(均P<0.05)。miRNA-19a和miRNA-19b-1表达与动脉狭窄程度(r=0.826、0.795,P<0.05)、斑块易损危险性(r=0.701、0.658,P<0.05)呈正相关。miRNA-19a和miRNA-19b-1预测高危斑块的AUC分别为0.774和0.685,二者联合检测可将AUC提高至0.814。结论血清miRNA-19a、miRNA-19b-1与大脑中动脉M1段狭窄程度及斑块易损性密切相关,提示血清miRNA-19a、miRNA-19b-1可能是动脉狭窄和斑块易损的影响因素,可用于预测大脑中动脉M1段高危斑块。

miRNA-548ah调控HDAC4影响HBV复制和表达及临床意义

目的探讨微小RNA-548ah(miRNA-548ah)调控组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制和表达的影响及其在肝组织中的表达与相关性。方法选择2015年-2017年泰州市人民医院诊治的慢性HBV感染患者18例为研究对象,其中慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者9例,乙型肝炎肝硬化(LC)患者9例,荧光定量PCR检测三种不同肝癌细胞株及CHB患者肝组织中miRNA-548ah和HDAC4分子的表达,应用miRNA-548ah模拟剂和抑制剂转染Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞,检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达水平;Pearson相关分析CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4表达与临床指标的相关性。结果 miRNA-548ah和HDAC4在Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞的表达差异具有统计学意义(P<0.001);转染pHBV1.3质粒的HepG2细胞、Huh7细胞、HepG2,2,15细胞中,与对照组比较,miRNA-548ah模拟剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达均升高,miRNA-548ah抑制剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达均降低(P<0.001);CHB患者肝组织中miRNA548ah的表达为(0.90±0.56),低于乙肝LC患者的表达(1.62±0.71)(P<0.05);CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4的表达呈负相关(r=-0.746,P=0.021),肝组织中HDAC4的表达水平与血清ALT的水平呈正相关(r=0.733,P=0.025)。结论 miRNA-548ah可通过靶向HDAC4调控乙型肝炎病毒的复制与表达,并且影响CHB的病情进展。

miRNA-548a-5p在预测特发性肺动脉高压患者血流动力学恶化的作用

目的研究特发性肺动脉高压(IPAH)患者血浆中的miRNA-548a-5p预测血流动力学恶化的价值。方法回顾性纳入2010年5月至2017年6月在上海市肺科医院住院的12例IPAH患者及12名对照者。所有患者均进行了右心导管检查。通过miRNA微阵列基因芯片分析患者和正常对照差异表达的miRNA。线性回归分析miRNA-548a-5p对血流动力学相关参数升高的预测作用。受试者工作特征曲线分析miRNA-548a-5p鉴别患者和对照人群效能。结果IPAH患者和对照人群的一般情况差异无统计学意义。IPAH组miRNA-548a-5p表达明显高于对照组(t=3.038,P<0.05)。部分血流动力学参数和miRNA-548a-5p呈良好的相关性。多重线性回归分析提示miRNA-548a-5p表达水平是预测IPAH患者平均肺动脉压和肺血管阻力升高的独立预测因子。受试者工作特征曲线分析结果显示miRNA-548a-5p的临界值为10.5,其表达水平升高,血流动力学恶化。结论血浆中miRNA-548a-5p可能是预测IPAH患者血流动力学恶化的生物标志物。

血液miRNA-548ah在慢性乙型肝炎病毒感染不同时期的表达及其临床价值

目的探讨血液miRNA-548ah在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染不同时期的表达,并分析其临床价值。方法选取2015年1月至2019年1月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的108例慢性HBV感染者为研究对象(HBV感染组),根据分期不同将108例患者分为免疫耐受期组(32例)、免疫清除期组(28例)、低复制期组(25例)和再活动期组(23例);另外选取同期100例健康体检者为对照组。采用采用Exo Quick试剂盒提取血液外泌体,并采用Western blot蛋白质印记法验证外泌体的真实性;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血液外泌体中miRNA-548ah水平,并收集其血清HBV DNA和丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。比较HBV感染组患者和对照组血液外泌体miRNA-548ah差异,并绘制ROC曲线探讨血液外泌体miRNA-548ah在慢性HBV感染不同时期中的应用价值,采用Pearson相关法分析血液外泌体miRNA-548ah与HBV DNA和ALT的关系。结果蛋白质免疫印迹法检测外泌体表面特异性标志物CD63和Tsg101蛋白阳性,提示外泌体提取成功。HBV感染组和对照组血液外泌体miRNA-548ah水平分别为(3.46±0.83)和(0.72±0.15),差异有统计学意义(t=32.518、P <0.001);ROC曲线分析显示,外泌体miRNA-548ah在慢性HBV感染诊断中具有一定价值(AUC=0.785、95%CI:0.723~0.877、截断值:1.04、敏感性为84.5%、特异度为82.6%)。免疫耐受期组、免疫清除期组、低复制期组和再活动期组血液外泌体miRNA-548ah分别为(4.18±1.34)、(1.41±0.45)、(1.32±0.31)和(1.48±0.42),差异有统计学意义(F=27.435、P <0.001);其中免疫耐受期组和免疫清除期组患者差异有统计学意义(t=10.427、P <0.001),免疫清除期组和低复制期组患者差异无统计学意义(t=0.838、P=0.406);低复制期组和再活动期组差异无统计学意义(t=1.510、P=0.138)。Pearson相关分析表明,HBV感染免疫耐受期miRNA-548ah与HBV DNA、ALT均呈显著正相关(r=0.857、P <0.001,r=0.763、P <0.001);HBV感染再活动期患者miRNA-548ah与HBV DNA、ALT均呈显著正相关(r=0.776、P=0.001,r=0.711、P=0.001);HBV感染免疫清除期mi RNA-548ah与HBV DNA、ALT呈正相关,但相关性不显著(r=0.572、P=0.035,r=0.531、P=0.042);HBV感染低复制期miRNA-548ah与HBV DNA、ALT呈正相关,但相关性不显著(r=0.541、P=0.039,r=0.502、P=0.048)。结论血液外泌体mi RNA-548ah在慢性HBV感染者高表达,有望成为诊断慢性HBV感染的新型标志物,且其在HBV感染自然史不同阶段的表达存在差异,与血清HBV DNA和ALT亦相关,可用于指导临床用药并进行及时调整。

lncRNA CTC-338M12.4抑制miRNA-27a-5p对JAK/STAT信号通路的激活使舌鳞状细胞癌细胞周期阻滞、细胞增殖和迁移受抑制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)CTC-338M12.4在舌鳞状细胞癌组织中的表达水平及其体外对舌鳞状细胞癌细胞周期、增殖、迁移的作用和分子机制。方法依据基因表达综合(GEO)数据库lncRNA系列数据集GSE139869数据,分析CTC-338M12.4在舌鳞状细胞癌组织和癌旁组织中的差异表达情况。利用反转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测人永生化口腔角质细胞株HOK及舌鳞状细胞癌细胞株HN13、TSCCa、CAL-27、Tca8113、SCC15中CTC-338M12.4转录水平的表达量。取CTC-338M12.4表达水平最低的CAL-27细胞,分为对照组(转染含阴性序列的载体)和CTC-338M12.4组(转染CTC-338M12.4过表达载体)。采用细胞克隆形成实验检测各组CAL-27细胞增殖能力,采用流式细胞术检测各组CAL-27细胞周期分布,采用划痕实验检测各组CAL-27细胞迁移能力。应用lncACTdb数据库预测CTC-338M12.4与miRNA-27a-5p(miR-27a-5p)有互补结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验进行验证。通过qRT-PCR检测各组CAL-27细胞中miR-27a-5p表达水平。通过蛋白质印迹法检测各组CAL-27细胞中JAK/STAT信号通路相关因子的蛋白表达水平。结果对GEO数据库相关数据分析显示,舌鳞状细胞癌组织中转录水平CTC-338M12.4低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.001)。舌鳞状细胞癌HN13、TSCCa、CAL-27、Tca8113、SCC15细胞中转录水平CTC-338M12.4均低于HOK细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。CTC-338M12.4组CAL-27细胞中CTC-338M12.4转录水平相对表达量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。细胞克隆形成实验显示,CTC-338M12.4组CAL-27细胞克隆数比对照组少[(51±10)个比(114±21)个],差异有统计学意义(t=2.71,P=0.035)。流式细胞术检测显示,CTC-338M12.4组CAL-27细胞中G0/G1期细胞比例高于对照组[(64±3)%比(43±4)%],差异有统计学意义(t=4.87,P=0.003)。划痕实验显示,划痕时两组划痕宽度相近(P>0.05),划痕25 h后CTC-338M12.4组CAL-27细胞划痕宽度较对照组宽[(133±15)μm比(64±10)μm],差异有统计学意义(t=3.78,P=0.009)。双荧光素酶报告基因实验显示,与共转染野生型CTC-338M12.4序列和miR-27a-5p无关序列的CAL-27细胞相比,共转染野生型CTC-338M12.4序列和miR-27a-5p序列的CAL-27细胞相对荧光素酶活性低,差异有统计学意义(P<0.001)。CTC-338M12.4组CAL-27细胞转录水平miR-27a-5p相对表达量低于对照组,差异有统计学意义(P=0.003)。蛋白质印迹法检测显示,JAK/STAT信号通路p-JAK、p-STAT、p-Raf、p-ERK、p-mTOR蛋白表达量均低于对照组。结论舌鳞状细胞癌中lncRNA CTC-338M12.4水平较低。CTC-338M12.4在舌鳞状细胞癌CAL-27细胞中可能通过抑制miR-27a-5p表达而介导JAK/STAT信号通路失活,从而导致细胞周期阻滞及抑制细胞增殖和迁移。