环状RNA_PLEKHM3通过miR-320/KLF4轴调控宫颈癌细胞上皮间质转化

目的探讨环状RNA含普列克底物蛋白同源域的家族M3成员(PLEKHM3)(circRNA_PLEKHM3)通过调控微小RNA-320(miR-320)/畸变样因子4(KLF4)轴在宫颈癌细胞上皮间质转化(EMT)行为中的作用与机制。方法采用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测宫颈癌细胞Hela和CaSki中circRNA_PLEKHM3的表达水平;RNA荧光原位杂交检测circRNA_PLEKHM3在人宫颈癌上皮细胞CaSki中的定位;双荧光素酶报告基因实验检测circRNA_PLEKHM3和miR-320的靶向关系,以及miR-320和KLF4的靶向关系;对CaSki细胞过表达circRNA_PLEKHM3;另外设置三组,分别为在过表达circRNA_PLEKHM3的基础上过表达miR-320、沉默KLF4,以及在过表达miR-320的基础上沉默KLF4。qRT-PCR检测CaSki中miR-320的表达水平;Western blot检测CaSki细胞中KLF4和EMT标志物上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达;Transwell实验检测细胞迁移数和侵袭细胞数。结果circRNA_PLEKHM3在Hela和CaSki中的表达均降低(P<0.05),其主要定位在细胞质中;双荧光素酶报告基因实验显示miR-320和circRNA_PLEKHM3存在靶向关系,KLF4和miR-320存在靶向关系;过表达circRNA_PLEKHM3抑制miR-320和N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的蛋白表达,上调E-cadherin的蛋白表达,减少细胞迁移和侵袭数(P<0.05);在过表达circRNA_PLEKHM3的基础上过表达miR-320或沉默KLF4均能够促进miR-320和N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表达,上调E-cadherin蛋白的表达,减少迁移和侵袭细胞数(P<0.05);然而在过表达miR-320的基础上沉默KLF4,KLF4和N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表达受到抑制,E-cadherin蛋白的表达上调,细胞迁移和侵袭数减少(P<0.05)。结论circRNA_PLEKHM3过表达可能通过miR-320/KLF4轴调控宫颈癌细胞的EMT。

通督调神针刺法治疗急性脑梗死病人的临床疗效观察及疗效机制探讨

目的观察通督调神针刺法治疗急性脑梗死病人的疗效,探讨通督调神针刺治疗急性脑梗死病人的疗效机制。方法前瞻性研究2021年4月至2022年10月合肥市第一人民医院住院的72例急性脑梗死病人按随机抽签法随机分成观察组38例(通督调神针刺法治疗)和对照组34例(常规针刺法治疗)。两组病人纳入研究前均错过最佳溶栓时间窗,未给予溶栓治疗,全部给予调节血糖、血压、抗血小板聚集、稳定斑块、改善脑循环及神经保护等基础治疗。观察组按通督调神针刺法选取水沟、百会、风府、大椎、至阳、腰阳关等督脉穴位,对照组按普通针刺法选取血海、内关、极泉、尺泽、三阴交、委中等穴位,均针刺1次/天,每次留针40 min,每周治疗6次,共治疗4周。使用神经功能评分量表(NIHSS评分量表)、运动功能评分量表(FMA评分量表)和日常生活能力评分量表(MBI评分量表)对两组病人治疗前及治疗4周后进行评分,同时测定两组病人治疗前及治疗4周后血清微RNA-320(miRNA-320)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达水平。结果治疗4周后,对照组、观察组NIHSS评分[(16.82±1.29)、(15.97±1.72)分]、miRNA-320表达水平[(0.90±0.98)、(0.50±0.45)mg/L]均较治疗前[NIHSS评分为(17.35±1.65)、(17.53±1.66)分,miRNA-320表达(1.86±1.47)、(1.79±1.84)mg/L]明显下降(P<0.05),且观察组NIHSS评分、miRNA-320表达水平降低程度均显著大于对照组(P<0.05);两组FMA评分、MBI评分、IGF-1表达水平均较治疗前明显升高(P<0.05),且观察组FMA评分、MBI评分、IGF-1表达水平升高程度显著大于对照组(P<0.05)。治疗4周后观察组的总有效率为94.74%(36/38),对照组的总有效率为85.29%(29/34)(P<0.05)。结论通督调神针刺法和普通针刺法均能改善急性脑梗死病人神经功能、运动功能及日常生活能力,且通督调神针刺组临床疗效显著高于普通针刺组,其机制可能是通过抑制miRNA-320表达并上调IGF-1的表达所致。

毛竹PhcircRNA1的鉴定和调控通路分析

环状RNA(circRNAs)是一类经过反向剪切后,3′末端和5′末端共价结合形成的闭合环状单链非编码RNA,在环境胁迫下对植物生长发育有着重要调控作用。为探索circRNA在毛竹响应胁迫过程中的调控作用,本研究构建了circRNA-miRNA-mRNA调控通路。在分析毛竹的全转录组测序数据后,选择并鉴定了1个在紫外线胁迫(UV)和高温胁迫(42℃)下均差异表达的circRNA(PhcircRNA1),并利用生物信息学分析其调控的miRNA和靶基因。通过核糖核酸酶R(RNase R)法鉴定其转录的稳定性,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析了PhcircRNA1、靶miRNA(Ph-miR156)和靶mRNA的表达特征。本研究进一步选择GLR3.1(Glutamate Receptor–Like Gene 3.1)靶基因作为研究对象,观察毛竹水培苗根尖生长至1 cm后的circRNA-miRNA-mRNA表达调控趋势。结果表明,在UV胁迫和高温胁迫下,PhcircRNA1和靶mRNA表达量都有明显下降趋势,而miRNA表达量增高。在毛竹根尖细胞中,PhcircRNA1和GLR3.1表达量变化一致,和Ph-miR156相反。结果表明PhcircRNA1可能通过竞争性内源RNA(ceRNA)机制参与毛竹非生物胁迫响应,并在毛竹生长发育中起重要作用。本研究为进一步研究PhcircRNA1的功能奠定了理论基础。

黄芩苷调节let-7i-3p/PI3K/Akt/NF-κB信号轴减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞NLRP3炎性小体活化

目的研究黄芩苷减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)NLRP3炎性小体活化的作用及机制。方法为证实黄芩苷减轻HFLS-RA中NLRP3炎性小体活化,采用免疫荧光观察黄芩苷处理前后NLRP3的表达;Western blot检测黄芩苷处理48 h后,p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白的表达;ELISA检测细胞上清中IL-1及IL-18的含量。为探究黄芩苷减轻NLRP3炎性小体活化的机制,采用双荧光素酶及Western blot验证let-7i-3p与PIK3CA的对应关系;RT-qPCR检测黄芩苷干预前后let-7i-3p及PI3K的表达;采用let-7i-3p干扰,验证黄芩苷是否减轻了增强的NLRP3炎性小体的活化。结果50、100 mg·L^(-1)黄芩苷明显减轻了NLRP3炎性小体的活化,抑制p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白的表达,抑制IL-1、IL-18的分泌。let-7i-3p与PIK3CA存在靶向对应关系,黄芩苷上调了let-7i-3p的表达、下调了PIK3CA的表达;黄芩苷减轻了因let-7i-3p干扰而增强的NLRP3炎性小体的活化。结论黄芩苷经上调let-7i-3p表达、抑制PI3K/Akt/NF-κB信号转导,从而减轻NLRP3炎性小体的活化。

三氯乙烯药疹样皮炎患者血清miRNAs差异表达谱分析

目的:分析三氯乙烯药疹样皮炎(OMLDT)患者和三氯乙烯接触者血清micro RNA(mi RNA)表达谱的差异。方法:分别采集5名三氯乙烯药疹样皮炎患者和5名接触者血液,分离血清,抽提总RNA进行Hy3荧光标记,然后浓缩标记的样品,运用mi RCURY LNA芯片进行mi RNA芯片杂交,杂交后进行图像扫描,所得数据使用Gene Pix Pro V6.0软件进行mi RNA差异表达分析并采用q PCR进行验证。对差异较大的mi RNA用mi RWalk 2.0进行靶基因预测,并与其他预测软件结果进行比较。结果:OMLDT患者与三氯乙烯接触者比较,共有69个差异表达的mi RNAs,其中低表达30个,高表达39个(包含mi R-199b)。q PCR验证亦显示mi R-199b在OMLDT中高表达。靶基因预测结果显示mi R409-3p和mi R485-3p在5个预测软件均预测到了共同的靶基因。结论:三氯乙烯药疹样皮炎患者血清mi RNAs表达谱发生了显著改变,mi R-199b可能是OMLDT潜在的易感生物标志物。

高脂饮食诱导胰岛素抵抗小鼠血浆microRNA表达谱及其与TLR4的关系

目的:筛选高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠,以及应用Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)抑制剂TAK-242干预的胰岛素抵抗小鼠血浆差异表达的微小RNA(microRNA,miRNA),探讨胰岛素抵抗、TLR4和差异表达miRNAs的关系。方法:血浆标本来自前期实验的3组小鼠,即以普通基础饲料喂养(Low fat diet,LFD)的正常对照组、给予TAK-242的高脂饮食组(Treated high fat diet,HFD-T)和单纯高脂饮食组HFD-C,应用小鼠miRNA芯片检测血浆miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNAs;采用实时荧光定量PCR方法验证芯片结果。应用生物信息学方法,以TLR4及其信号传导通路为中心,预测差异表达miRNAs的靶基因,并对靶基因分别进行GO和KEGG富集分析,以判定差异miRNAs主要影响的生物学功能或者通路。结果:miRNA基因芯片筛查结果显示,单纯高脂饮食组与正常饮食组比对,筛选出差异显著的miRNAs共计185种,其中6种miRNAs表达上调,179种miRANs表达下调;给予TAK-242的高脂饮食组与正常饮食组比对,筛选出差异显著的miRANs共计171种,均表达下调;给予TAK-242的高脂饮食组与单纯高脂饮食组比对,筛选出差异表达的miRNAs共计13种,均为下调。生物信息学分析结果显示,以TLR4为中心挖掘与其互作的蛋白质,共发现有10种蛋白;在TAK-242给予的高脂饮食组与单纯高脂饮食组中差异表达倍数均在1 000以上的4种miRNAs(mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmumiR-335-3p),可在TLR4的互作蛋白质或Toll样受体信号通路中找到其作用的靶基因,发现这些靶基因74%属于生物过程基因,其中转录调控因子占82%。实时荧光定量PCR检测mmu-miR-3095-3p、mmu-miR-5113、mmu-miR-709和mmu-miR-335-3p水平,变化趋势与芯片结果一致。结论:胰岛素抵抗发生时,血浆miRNAs表达谱存在改变,此变化与TLR4及其信号通路相关。该研究结果丰富了胰岛素抵抗发生的机制,为寻找胰岛素抵抗血浆miRNAs诊断标志物提供了实验依据。

microRNA-1诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的研究microRNA-1(miRNA-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化。方法构建大鼠miRNA-1表达载体,分离扩增培养及鉴定大鼠MSCs。脂质体法转染大鼠第4代MSCs,实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测转染miRNA-1质粒后MSCs的miRNA-1表达水平。分别于转染2、4和6 d后用RT-PCR检测心肌重要转录因子GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达,免疫荧光检测心肌特异蛋白I(cTnI)的表达。结果 90%以上的MSCs表达MSCs重要标志物CD29、CD44;未检测到造血前体细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45的表达。转染miRNA-1质粒后,miRNA-1表达水平明显上调。转染miRNA-1质粒2、4和6 d后,GATA4、NKx2.5和MEF2C的mRNA表达逐渐增强。第4和6天后可见cTnI阳性表达细胞。结论 miRNA-1能诱导大鼠MSCs向心肌样细胞分化。

miRNA-27a对实验性肺结核大鼠免疫功能的调控作用及其机制

目的:探讨miRNA-27a对实验性肺结核模型大鼠免疫功能的调控作用,阐明其可能的作用机制。方法:经尾静脉注射结核杆菌悬液建立肺结核大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、miR-27a激动剂对照(agomir-NC)组和miR-27a激动剂(agomir)组,另取正常大鼠设为对照组,每组12只。agomir-NC组和agomir组大鼠经尾静脉注射agomir-NC或miR-27a agomir干预,每天1次,连续5 d。3周后,计算各组大鼠脾脏和胸腺指数,HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态表现,流式细胞术检测各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群百分率,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组大鼠肺组织中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组大鼠肺组织中miR-27a表达水平,Westernblotting法检测各组大鼠肺组织中Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκB(p-IκB)和NF-κB p65蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠肺组织损伤严重,脾脏及胸腺指数、外周血中CD4+T淋巴细胞百分率和肺组织中miR-27a表达水平及IκB蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),外周血中CD8+T淋巴细胞百分率及肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和TLR4、p-IκB及NF-κB p65蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与模型组比较,agomir组大鼠肺组织病理形态表现明显改善,脾脏和胸腺指数、外周血中CD4+T淋巴细胞百分率、肺组织中miR-27a表达水平及IκB蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),外周血中CD8+T淋巴细胞百分率及肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和TLR4、p-IκB、NF-κB p65蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),agomir-NC组大鼠上述各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达miR-27a可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路活化,减少炎症因子释放,调节机体免疫反应,从而改善肺结核大鼠肺损伤。

猪Toll样受体7基因人工miRNA表达质粒的构建与筛选

目的构建猪Toll样受体7(TLR7)基因的人工miRNA(amiRNA)特异性表达载体,筛选有效amiRNA。方法 RT-PCR扩增猪TLR7基因的1984～2648 bp序列,构建融合表达载体pTLR7-EGFP。设计针对猪TLR7的5对amiRNA,构建重组干扰质粒pcDNA5-miRTLR7。将pcDNA5-miRTLR7和pTLR7-EGFP共转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR检测amiTLR7的表达,以荧光显微镜观察和流式细胞术分析干扰效率。结果 5个amiTLR7都成功表达,且均能沉默NIH-3T3细胞中TLR7基因的表达,抑制效率为36.99%到97.28%,其中amiTLR7-3效果最佳。结论成功构建了针对猪TLR7基因的amiRNA表达质粒,筛选出了沉默猪TLR7基因的最佳干扰序列。

血清miRNA-574-3p,AFP,IGF-2水平联合检测在肝癌早期诊断中的价值研究

目的 探讨血清miRNA-574-3p,甲胎蛋白(alpha-fetoprotein), AFP、胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor 2, IGF-2)联合诊断早期肝癌的价值。方法 选取2019年4月~2020年11月南通大学附属医院确诊的85例早期肝癌患者和90例健康体检者为研究对象,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time fuorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)测定血清中miRNA-574-3p水平,化学发光法检测血清AFP浓度,ELISA法检测IGF-2浓度,分析三者对早期肝癌的诊断价值。结果 早期肝癌组miRNA-574-3p,AFP和IGF-2分别为1.40±0.28 RQ,94.13±25.05 ng/ml和432.50±104.01 ng/ml,显著高于健康对照组(0.55±0.10 RQ,10.05±3.34ng/ml和189.40±52.36ng/ml),差异有统计学意义(t=5.368,12.401,18.514,均P <0.05)。miRNA-574-3p,AFP和IGF-2诊断早期肝癌的曲线下面积分别为0.801,0.787和0.762,其中miRNA-574-3p曲线下面积最大。AFP,IGF-2分别联合miRNA-574-3p诊断早期肝癌的曲线下面积为0.870,0.853,三者联合诊断价值最高,曲线下面积为0.917。结论 相比于AFP和IGF-2,miRNA-574-3p对早期肝癌诊断价值更高,临床上可通过miRNA-574-3p联合AFP,IGF-2共同诊断以提高诊断效能。

Toll样受体4的表达及miR-TLR4干扰对HBV相关肝癌细胞生物学活性的影响

目的观察Toll样受体4在乙肝病毒相关肝癌细胞系中的表达及对其生物学活性的影响。方法Western blot检测Hep3B、Hep G2.2.15、Hep G2、SMMC7721及Huh7五种肝癌细胞中TLR4蛋白表达情况,选择TLR4表达高的HBV阳性肝癌细胞作为研究对象。构建4个mi R-TLR4质粒和一个阴性对照质粒,选择干扰效果明显的质粒转染TLR4表达高的HBV阳性肝癌细胞。实验分为正常组,阴性对照组,干扰质粒3组及干扰质粒4组。通过MTT法、克隆平板形成实验、流式细胞术分别检测干扰TLR4表达对肝癌细胞增殖、克隆形成、周期及凋亡的影响。结果 TLR4基因在五种肝癌细胞株中均有表达,在Hep3B细胞中表达最高。与正常组和阴性对照组相比,干扰TLR4表达后,Hep3B细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),克隆形成率显著下降(P<0.05),周期阻滞于G2/M期,并促进细胞凋亡(P<0.05)。结论 TLR4表达上调促进HBV相关肝癌细胞Hep3B生长增殖、周期再分布以及抑制凋亡,在肝癌发生发展过程中起重要作用。

Antagomir-320对胫骨骨折小鼠围术期神经认知障碍的影响

目的探究antagomir-320对胫骨骨折小鼠围术期神经认知障碍及相关蛋白IGF-1、APP的影响。方法选择健康雄性C57/BL小鼠120只,12~14周龄,体重20~30 g,采用随机数字表法将其分为4组(n=30):正常对照组(C组)、麻醉手术组(AS组)、局部海马注射生理盐水+麻醉手术组(NS组)、局部海马注射antagomir-320+麻醉手术组(AT组)。于术后1、3、7 d进行Morris水迷宫实验和旷场实验,进行神经行为学评分,取海马组织,Western blot检测海马组织胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、淀粉样前体蛋白(APP)表达,qRT-PCR检测miRNA-320与IGF-1 mRNA表达变化。结果与C组比较,术后AS组、NS组、AT组逃避潜伏期均延长,靶象限停留时间百分比均降低(P<0.05);AS组、NS组术后miRNA-320表达升高,IGF-1mRNA表达降低,APP蛋白表达升高;AT组术后miRNA-320表达降低,IGF-1mRNA在术后1 d表达降低,术后3、7 d升高,呈逐渐升高趋势,术后1、3 d APP蛋白表达升高,然后逐渐降低(P<0.05)。与NS组相比,AT组逃避潜伏期缩短,靶象限停留时间百分比增高,miRNA-320表达降低,IGF-1mRNA及蛋白表达升高,APP蛋白表达升高(P<0.05)。NS与AS组相比,术后1、3、7 d差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Antagomir-320能改善胫骨骨折小鼠围术期认知功能障碍。

连续性血液滤过治疗对严重脓毒症患者炎症介质及单核细胞中TLR4和miRNA-146a的影响

目的 探讨连续性血液滤过（CBP）治疗对严重脓毒症患者血液中炎症介质、单核细胞中Toll样受体4（TLR4）和miRNA-146a的影响.方法 选择符合纳入标准的脓毒症患者40例,分为CBP组及脓毒症组,另选15例健康医务人员为对照组.动态检测患者第0、12、24、48、72 h血液中TNF-α、IL-1、IL-6水平及外周血单核细胞中TLR4 mRNA、TLR4、miRNA-146a的表达量的变化,并将TLR4 mRNA、TLR4的表达水平和miRNA-146a的表达水平进行相关性分析.结果 CBP组及脓毒症组TNF-α、IL-1及IL-6的分泌水平较治疗前皆有不同程度下调（P＜0.05）,CBP组下调幅度明显大于脓毒症组.CBP组随着治疗的进行,TLR4 mRNA、TLR4及miRNA-146a的表达水平较治疗前有所下调（P＜0.05）,在第24 h前只有小幅度下调,而在第48 h才出现明显下调；脓毒症组在治疗后第72 h才出现小幅度下调.CBP组miRNA-146a表达水平与TLR4 mRNA、TLR4的表达水平呈正相关（P ＜0.001）.结论 CBP不仅能有效地清除脓毒症患者循环中高浓度的炎症因子,同时还可以对参与炎症反应发生和发展的相关分子,如TLR4及miRNA-146a进行调节,从而发挥对脓毒症的治疗作用.

微小RNA在类风湿关节炎Toll样受体信号通路中的研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性滑膜增生导致的进行性软骨及骨质破坏的自身免疫病,致残致畸率高,病因尚不完全清楚。目前RA治疗主要包括非甾体类抗炎药、激素、慢作用抗风湿药及生物制剂,尽管提高了疾病缓解率,但对已经形成的关节破坏无法修复,且存在副作用大、价格昂贵等缺点,因此急需寻找一种新的治疗手段,而深入了解RA的发病机制则尤为关键。本文综述了微小RNA在RA Toll样受体信号通路中的调控作用,以期为寻找新的RA治疗靶点提供参考。

Luminal型与Basal-like型乳腺癌差异miRNAs的表达与预后分析

目的分析Luminal型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的microRNAs(miRNAs),探讨其表达水平与Luminal型和Basal-like型乳腺癌预后的关系。方法从基因表达综合数据库(GEO)中下载包含Luminal和Basal-like乳腺癌患者相关的miRNAs微阵列数据集GSE81000与GSE40267,利用GEO2R在线分析工具筛选Luminal和Basal-like乳腺癌之间差异表达的miRNAs。通过mirDIP数据库预测其靶基因,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-468中验证miRNAs的差异表达。利用METABRIC数据库,采用KaplanMeier Plotter在线工具分析miR-199a-5p和miR-199b-5p表达水平与Luminal型和Basal-like型乳腺癌预后的关系。结果筛选出了35种在Luminal型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的miRNAs。相较于Luminal型,18种miRNAs在Basal-like型中表达下调,17种表达上调。靶基因预测结果显示,35种差异表达miRNAs的潜在靶基因共4180个,其中最相关的靶基因有19个,对应的差异miRNAs为miR-199a-5p、miR-199b-5p。相较于Luminal型乳腺癌,miR-199a-5p和miR-199b-5p在Basal-like型乳腺癌中表达下调。qRT-PCR检测结果表明,miR-199a-5p和miR-199b-5p在MCF-7(Luminal型)和MDA-MB-468(Basal-like型)细胞中的表达水平与GEO2R分析结果趋势一致。生存分析结果表明,miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低显著相关。结论共筛选出35个在Luminal型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的miRNAs。其中,miR-199a-5p、miR-199b-5p与乳腺癌的预后相关,有望成为治疗的新靶点。

微小RNA-146a靶向调控Krüppel样转录因子7对强直性脊柱炎T细胞炎症反应及自噬的影响

目的探讨微小RNA-146a(miR-146a)是否通过靶向调控Krüppel样转录因子7(KLF7)的表达而影响强直性脊柱炎病人T细胞炎症反应及自噬。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测强直性脊柱炎病人T细胞与健康人T细胞中miR-146a的表达量;分别将anti-miR-NC、anti-miR-146a、pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF7转染至强直性脊柱炎病人T细胞;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-23(IL-23)的水平;双荧光素酶报告实验验证miR-146a与KLF7的靶向结合关系;蛋白质印迹法(Western blotting)检测KLF7、自噬相关基因5(ATG5)、Beclin-1的表达量。结果与健康人T细胞比较,强直性脊柱炎病人T细胞中miR-146a的表达量升高[(1.00±0.08)比(2.74±0.13),t=53.54,P<0.05];与anti-miR-NC组比较,anti-miR-146a组IL-6[(823.17±14.10)ng/L比(372.31±11.03)ng/L]、IL-17[(901.00±16.29)ng/L比(428.39±12.34)ng/L]、IL-23[(886.38±15.11)ng/L比(401.61±11.75)ng/L]的水平降低(t=43.62,40.06,43.87,P<0.05),ATG5[(0.33±0.03)比(0.79±0.07)]、Beclin-1[(0.42±0.04)比(0.91±0.08)]蛋白水平升高(t=10.46,9.49,P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-146a可靶向结合KLF7;转染pcDNA3.1-KLF7可明显降低IL-6[(823.17±14.10)ng/L比(477.37±12.01)ng/L]、IL-17[(901.00±16.29)ng/L比(558.67±13.16)ng/L]、IL-23[(886.38±15.11)ng/L比(531.69±12.75)ng/L]的水平(t=32.34,28.31,31.07,P<0.05),提高ATG5[(0.32±0.03)比(0.60±0.06)]、Beclin-1[(0.44±0.04)比(0.78±0.07)]的表达水平(t=7.23,7.30,P=0.002)。结论抑制miR-146a表达可通过靶向KLF7而抑制强直性脊柱炎病人T细胞炎症反应及促进细胞自噬。

miRNA-505-3p在原发性高血压发病机制中的作用

目的探讨miRNA-505-3p在原发性高血压(EH)发生机制中的作用。方法选择2014年5~8月于陆军军医大学附属第二医院收治的EH患者和非EH患者各60例,采集患者静脉血,分离血浆,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血浆中miRNA-505-3p相对表达量,采用酶联免疫吸附试验检测血浆中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平。培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC),当细胞融合度达到50%~70%时随机分为mimic组(转染miRNA-505-3p mimic序列)、mimic对照组(转染mimic对照序列)和空白对照组(不进行转染);转染后继续培养72 h,然后收集细胞及细胞培养液。采用实时荧光定量PCR检测3组HASMC中miRNA-505-3p及IGF-1 mRNA表达,细胞计数试剂盒-8检测3组HASMC的活性,Western blot法检测3组HASMC中IGF-1蛋白表达。结果 EH患者与非EH患者血浆中miRNA-505-3p相对表达量分别为0. 156 5±0. 025 9、0. 007 9±0. 001 4,EH患者血浆中miRNA-505-3p相对表达量显著高于非EH患者(t=6. 880,P <0. 01)。EH患者和非EH患者血浆miRNA-505-3p的受试者工作特征曲线下面积为0. 988 1,95%可信区间为0. 972 4~0. 999 0(P <0. 01)。EH患者和非EH患者血浆中IGF-1水平分别为(1 338. 03±96. 92)、(620. 90±23. 19) ng·L-1,EH患者血浆中IGF-1水平显著高于非EH患者(t=7. 101,P <0. 01)。mimic组、mimic对照组和空白对照组HASMC活性分别为0. 679 7±0. 032 8、0. 471 0±0. 024 5、0. 525 2±0. 035 3;mimic组HASMC活性显著高于mimic对照组和空白对照组(t=6. 203、4. 610,P <0. 05),mimic对照组与空白对照组HASMC活性比较差异无统计学意义(t=1. 432,P> 0. 05)。mimic组、mimic对照组和空白对照组HASMC中miRNA-505-3p相对表达量分别为0. 693 3±0. 022 9、0. 020 6±0. 000 8、0. 023 8±0. 001 1,mimic组HASMC中miRNA-505-3p相对表达量显著高于mimic对照组和空白对照组(t=7. 991、5. 840,P <0. 01),mimic对照组与空白对照组HASMC中miRNA-505-3p相对表达量比较差异无统计学意义(t=0. 323,P> 0. 05)。mimic组、mimic对照组和空白对照组HASMC中IGF-1 mRNA相对表达量分别为0. 238 6±0. 013 3、0. 082 4±0. 004 0、0. 079 7±0. 004 7,mimic组HASMC中IGF-1 mRNA相对表达量显著高于mimic对照组和空白对照组(t=16. 903、18. 240,P <0. 01),mimic对照组与空白对照组HASMC中IGF-1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(t=0. 295,P> 0. 05)。mimic组、mimic对照组和空白对照组HASMC中IGF-1蛋白相对表达量分别为0. 602 0±0. 017 3、0. 040 3±0. 006 2、0. 051 6±0. 001 0; mimic组HASMC中IGF-1蛋白相对表达量显著高于mimic对照组和空白对照组(t=29. 026、31. 557,P <0. 01),mimic对照组与空白对照组HASMC中IGF-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=0. 516,P> 0. 05)。结论 EH患者血浆miRNA-505-3p表达上调,miRNA-505-3p可能通过调控IGF-1表达而参与EH的发病,并可作为EH的生物学标志物。

lncRNA-NORAD表达对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响及其机制

目的:研究长链非编码RNA(lncRNA)-DNA损伤诱导的非编码RNA(NORAD)在食管癌Eca-109细胞中的表达,分析沉默NORAD通过miR-26a-5p/Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)对食管癌Eca-109细胞生物学行为的影响。方法:收集45例食管癌患者癌组织和40例癌旁正常组织标本,培养正常人食管鳞状上皮Het-1A细胞和食管癌Eca-109细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测癌组织、癌旁正常组织、Het-1A细胞和Eca-109细胞中NORAD mRNA、miR-26a-5p和ULK1 mRNA表达水平。采用miRanda数据库检测NORAD与miR-26a-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测NORAD与miR-26a-5p的关系。根据实验目的和转染质粒的不同,Eca-109细胞分为siRNA NC组和NORAD siRNA组,inhibitor NC组和miR-26a-5p inhibitor组,pcDNA-3.1(+)+mimics NC组、pcDNA-NORAD+mimics NC组、pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组和pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平。采用TargetScan数据库检测miR-26a-5p与ULK1的结合位点,双荧光素酶报告基因实验检测miR-26a-5p与ULK1的关系。Eca-109细胞分为siRNA NC组和ULK1 siRNA组,采用MTT法检测各组细胞活性,Transwell法检测各组细胞中侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。Eca-109细胞分为siRNA NC+inhibitor NC组、NORAD siRNA+inhibitor NC组、siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组和NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组,采用RT-qPCR和Western blotting法检测各组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平。结果:与癌旁组织或Het-1A细胞比较,食管癌组织或Eca-109细胞中NORAD和ULK1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01),miR-26a-5p表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC组比较,NORAD siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。miRcode数据库和双荧光素酶报告基因检测,NORAD靶向miR-26a-5p。与inhibitor NC组比较,miR-26a-5p inhibitor组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-26a-5p mimics组比较,pcDNA-NORAD+miR-26a-5p mimics组细胞活性明显升高(P<0.01),侵袭细胞数明显增加(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。TargetScan数据库和双荧光素酶报告基因检测,miR-26a-5p靶向ULK1。与siRNA NC组比较,ULK1 siRNA组细胞活性明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞中E-cadherin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),N-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与siRNA NC+miR-26a-5p inhibitor组比较,NORAD siRNA+miR-26a-5p inhibitor组细胞中ULK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:沉默lncRNA-NORAD可抑制Eca-109细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(EMT),其机制可能是通过调控miR-26a-5p/ULK1轴实现的。

miR-933调控KLF6基因影响非小细胞肺癌的作用研究

背景与目的:miRNA被认为参与肿瘤的发生、发展过程,但miRNA与肺癌的关系仍不完全清楚,探讨miR-933调控Kruppel样锌指转录因子6(Kruppel-like zinc finger transcription factor 6,KLF6)对肺癌细胞系增殖、迁移侵袭和诱导凋亡的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQPCR)检测正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞、肺癌细胞系A549、H460细胞中miR-933的表达。采用RTFQ-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测KLF6 mRNA表达和蛋白水平。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和EdU法检测细胞增殖,采用transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,采用AnnexinⅤ-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色法检测细胞凋亡。结果:肺癌细胞系转染miR-933mimic组KLF6mRNA表达水平明显上调(P<0.05)。与阴性对照组相比,高表达miR-933能增加A549、H460细胞KLF6蛋白的相对表达水平(P<0.05)。过表达miR-933可抑制A549、H460细胞的增殖、迁移和侵袭能力,差异均有统计意义(P<0.05)。转染miR-933mimc后,A549和H460细胞的凋亡率均显著高于各阴性对照组(P<0.001)。结论:miR-933通过调控KLF6基因的表达,诱导肺癌细胞的凋亡,抑制肺癌细胞的增殖,降低肺癌细胞的迁移和侵袭能力,影响肺癌的发生、发展。

靶向调控Nrf2-ARE通路的miRNAs研究进展

活性氧类(reactive oxygen species,ROS)在体内产生与清除的失衡,往往是导致机体病变的重要因素。研究表明,多条信号通路参与调节机体内ROS的平衡,其中核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid 2 related factor 2-antioxidant responsive element,Nrf2-ARE)通路活化,能诱导抗氧化酶表达,从而清除过量的活性氧,发挥细胞保护作用。Nrf2-ARE通路是当前研究的热点通路之一,阐明该通路活化或失活的分子机制亦是目前研究的重点。微RNA(microRNAs,miRNAs)是真核生物中广泛存在的能调节基因表达的一类非编码、极短小RNA分子,目前已发现多种miRNAs可作用于Nrf2-ARE信号通路上的重要分子,调控其表达,进而参与调控信号通路的活化与失活,在维持机体氧化还原稳态中扮演重要角色。现就近年来参与调控Nrf2-ARE通路的miRNAs的研究进展做一综述,以期为进一步阐明该通路在维持机体氧化反应稳态中的作用提供帮助。