利用CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的B16细胞株

目的用新型CRISPR/PITCH系统构建表达CSDE1-EGFP的小鼠黑色素瘤B16细胞株,分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,并进行功能探讨。方法用微同源介导的末端连接(MMEJ)方法将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列插入到CSDE1基因最后一个外显子上;用流式细胞测量术、PCR、免疫荧光及活细胞成像来检测CSDE1-EGFP是否插入成功,检验EGFP的荧光强弱与CSDE1的表达高低是否一致;用Transwell小室法、小鼠荷瘤模型实验观察低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株之间的功能差异。结果分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,检测出EGFP表达强弱与CSDE1表达高低一致。观察到CSDE1蛋白表达量不同的B16细胞株在功能上有所差异。结论为研究CSDE1在其他肿瘤细胞内的动态定位以及因表达量不同而产生的功能差异,新型CRISPR/PITCH系统提供了快速有效的直观方法。