microRNA 20a通过核因子-κB信号通路影响肺炎模型幼鼠炎症水平的机制研究

目的 探讨microRNA 20a通过核因子-κB信号通路影响肺炎模型幼鼠炎症反应和T细胞亚群分型的机制。方法 30只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为两组:肺炎组和健康组,每组各15只。肺炎模型组采用刺破鼻黏膜后,从鼻腔滴入50μl链球菌液法制备小鼠链球菌性肺炎模型;健康组刺破鼻黏膜后,从鼻腔滴入50μl生理盐水。将肺炎细胞分成4组:对照组、脂多糖(LSP)组、LPS+miR-20a组、LSP+miR-20a+PDTC组,分别用模拟对照物、脂多糖、mir-20a模拟物转染细胞,过表达miR-20A的细胞在37℃时用NF-κB抑制剂PDTC(100μg/L)处理30 min。用逆转录定量聚合酶链反应检测miR-20a的血清表达水平。用酶联免疫吸附(ELISA)法检测临床血清和组织细胞中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)α和C-反应蛋白(CRP)的浓度。用Western blotting法检测核因子(NF)-κBα(iκbα)和磷酸化p-NF-κB的蛋白表达水平。分析NF-κB抑制剂PDTC对miR-20a诱导的细胞炎症反应的影响。结果 肺炎组miR-20a的表达水平510. 75±50. 21,高于健康组202. 36±39. 58(P <0. 05)。肺炎组血清IL-6、TNF-α、CRP水平均高于健康组,差异有统计学意义(F <0. 05)。与对照组相比,LPS组的炎症因子IL-6、TNF-α和CRP浓度增加(F <0. 05),IκBα和p-NF-κB蛋白表达水平升高(P <0. 05)。与LPS组相比,LPS+miR-20a组细胞IL-6、TNF-α和CRP的表达水平,IκBα和p-NF-κB蛋白的表达水进一步升高(P <0. 05)。与LPS+miR-20a组比较,NF-κB抑制剂PDTC对炎症因子表达有抑制作用(P <0. 05)。结论 miR-20a在肺炎小鼠模型中表达上调,miR-20a的过表达可能通过激活NF-κB信号通路促进炎症反应。

皮肤鳞状细胞癌组织miR-20a、miR-196a表达水平与临床病理特征和预后的关系

目的探讨皮肤鳞状细胞癌(CSCC)组织微小RNA(miR)-20a、miR-196a表达水平与临床病理特征和预后的关系。方法选取2014年1月至2018年1月在该院行手术切除并随访成功的CSCC患者316例作为研究对象。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测术中留取CSCC患者癌组织和癌旁组织(距离癌组织>3 cm)中miR-20a、miR-196a表达水平。分析miR-20a、miR-196a表达水平与CSCC临床病理特征的关系。采用多因素Logistic回归分析影响CSCC患者预后不良的因素。根据CSCC患者癌组织中miR-20a、miR-196a表达水平的均值分为miR-20a高表达组、miR-20a低表达组和miR-196a高表达组、miR-196a低表达组。绘制Kaplan-Meier曲线分析miR-20a高表达组、miR-20a低表达组和miR-196a高表达组、miR-196a低表达组患者的5年生存差异。结果与癌旁组织比较,CSCC患者癌组织中miR-20a表达水平降低,miR-196a表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、TNM分期及是否发生淋巴结转移CSCC患者的miR-20a、miR-196a表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。随访5年,58例CSCC患者死亡(死亡组),258例生存(存活组),5年总生存率为81.65%(258/316)。死亡组低分化患者比例、TNMⅢ期患者比例、有淋巴结转移患者比例及癌组织中miR-196a表达水平高于存活组,而癌组织中miR-20a表达水平低于存活组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移、miR-196a>0.94为影响CSCC患者预后不良的独立危险因素(P<0.05),而miR-20a>0.80为独立保护因素(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,癌组织中miR-20a高表达组患者的生存曲线高于miR-20a低表达组患者(Log-rankχ^(2)=4.152,P=0.042),癌组织中miR-196a高表达组患者的生存曲线低于miR-196a低表达组患者(Log-rankχ^(2)=4.879,P=0.027)。结论CSCC患者癌组织中miR-20a低表达、miR-196a高表达与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和不良预后有关,故miR-20a、miR-196a可能成为预测CSCC患者预后不良的新型生物标志物。

卵巢型子宫内膜异位症患者外周血ROS、PON-1水平和miR-20a表达水平及与病情的关系

目的探究卵巢型子宫内膜异位症(EMs)患者外周血氧自由基(ROS)、氧磷酶-1(PON-1)水平和miR-20a表达水平及与病情的关系。方法回顾性选取2020年3月至2023年3月在江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)进行治疗的113例卵巢型EMs患者纳入研究组,并根据美国生育协会分期标准对其进行分组:62例Ⅰ~Ⅱ期患者纳入轻度组,51例Ⅲ~Ⅳ期患者纳入重度组。另选30例在本院进行治疗的盆腔炎且子宫内膜正常患者纳入对照组。比较研究组与对照组患者、轻度组与重度组患者的ROS、PON-1水平和miR-20a相对表达水平,比较轻度组与重度组的血清炎症因子[白细胞介素(IL)-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,并探究其与患者病情严重程度的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析ROS、PON-1水平和miR-20a表达水平对重度卵巢型EMs的诊断价值。结果研究组患者的ROS水平和miR-20a相对表达水平分别为(485.55±32.12)pg/mL、2.48±0.33,均高于对照组患者[(326.26±28.12)pg/mL、1.03±0.24],PON-1水平为(152.23±8.78)pg/mL,低于对照组患者[(212.26±8.23)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。重度组患者的ROS水平和miR-20a相对表达水平分别为(498.22±18.45)pg/mL、2.64±0.37,均高于轻度组患者[(433.28±23.16)pg/mL、1.97±0.21],PON-1水平为(142.04±5.99)pg/mL,低于轻度组患者[(164.56±5.48)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。重度组患者的血清IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α水平分别为(33.26±2.45)、(29.55±3.16)、(39.45±2.78)、(29.88±2.64)pg/mL,均高于轻度组患者[(17.22±2.23)、(23.66±3.15)、(32.45±2.54)、(21.02±2.37)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。ROS水平,miR-20a相对表达水平,IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α水平与患者的临床分期呈正相关(r=0.847、0.751、0.862、0.685、0.830、0.859,P<0.05),PON-1水平与患者的临床分期呈负相关(r=-0.856,P<0.05)。ROS、PON-1水平,miR-20a相对表达水平诊断重度卵巢型子宫内膜异位的ROC曲线的曲线下面积(AUC)分别为0.991、0.997、0.936,具有较好诊断价值(P<0.05)。结论ROS水平、miR-20a相对表达水平在卵巢型EMs患者中升高,PON-1水平表达下调,且对其病情严重程度具有一定诊断价值,可用于临床辅助诊断。

螺旋CT灌注成像联合血清microRNA-20a、microRNA-210水平对非小细胞肺癌同步放化疗预后的预测价值

目的:探讨64层螺旋CT灌注(CTP)成像联合血清microRNA(miR)-20a、miR-210水平对非小细胞肺癌(NSCLC)同步放化疗预后的预测价值。方法:回顾性分析105例行同步放化疗的NSCLC患者的临床资料,同步放化疗结束2周后评估疗效,行CT检查并记录血流量(BF)、表面通透性(PMB)、对比剂平均通过时间(MTT),实时荧光定量PCR法检测血清miR-20a、miR-210水平。结果:同步放化疗结束2周后,缓解84例,未缓解21例。随访1 a,生存68例,死亡37例。缓解组BF、PMB及血清miR-20a、miR-210水平低于未缓解组,生存组低于死亡组(P<0.05);缓解组MTT长于未缓解组,生存组长于死亡组(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示BF、PMB、MTT、血清miR-20a、miR-210水平是预后不良的预测因子,OR(95%CI)分别为2.599(1.856~3.341)、2.100(1.748~2.452)、1.831(1.236~2.427)、3.117(2.197~4.038)、2.892(2.004~3.380)。5个指标在诊断界点串联预测的灵敏度、准确度、约登指数分别为72.97%、94.12%、0.671。结论:CTP成像参数BF、PMB、MTT及血清miR-20a、miR-210水平与NSCLC同步放化疗预后关系密切,指标联合可提高预后预测的特异度。

血清癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、microRNA-20a和microRNA-210联合检测对早期小细胞肺癌的诊断价值

目的探讨血清癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、microRNA-20a (miRNA-20a)和microRNA-210(miRNA-210)联合检测对早期小细胞肺癌(SCLC)的诊断价值。方法选择2016年6月至2017年5月秦皇岛市第二医院收治的60例早期SCLC患者作为观察组,另选择同期体检健康者30例作为对照组,采用双抗体夹心法检测血清CEA水平,采用化学发光分析法检测血清NSE水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miRNA-20a、miRNA-210的表达量,采用受试者工作特征曲线分析单项及血清CEA、NSE、miRNA-20a和miRNA-210联合检测对早期SCLC的诊断价值。结果观察组患者血清CEA、NSE、miRNA-20a及miRNA-210水平显著高于对照组(P<0.05)。血清miRNA-20a诊断早期SCLC的敏感度显著高于血清CEA、NSE和miRNA-210(P<0.05),血清NSE诊断早期SCLC的特异度高于血清CEA、miRNA-20a和miRNA-210(P<0.05),4项指标联合检测诊断早期SCLC的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值显著高于单个指标检测、2项指标联合检测及3项指标联合检测(P<0.05)。结论CEA、NSE、miRNA-20a和miRNA-210联合检测对SCLC的早期诊断具有较高的临床价值。

糖尿病性视网膜病变患者血清microRNA-20a-5p、VEGF水平变化及其临床意义

目的探讨糖尿病性视网膜病变(DR)患者血清microRNA-20a-5p(miR-20a-5p)、血管内皮生长因子(VEGF)水平变化及其临床意义。方法选取遵义市第一人民医院眼科2018年1月—2020年12月收治的82例DR患者为DR组,根据DR严重程度分为增殖型糖尿病性视网膜病变(PDR)组(n=27)和非增殖型糖尿病性视网膜病变(NPDR)组(n=55)。选取同期单纯T2DM患者为T2DM组,42例体检健康者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组血清miR-20a-5p mRNA相对表达量;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清VEGF水平;采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)、胶乳凝集反应法测定糖化血红蛋白(HbA1c)水平。Pearson相关性分析DR患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量与VEGF、FBG、HbA1c的相关性,多因素Logistic回归分析血清miR-20a-5p、VEGF与DR发生的关系,ROC曲线分析血清miR-20a-5p、VEGF对DR发生的预测价值。结果与T2DM组比较,DR组FBG、HbA1c、VEGF水平升高,血清miR-20a-5p mRNA相对表达量降低,与对照组比较,T2DM组FBG、HbA1c、VEGF水平升高,血清miR-20a-5p mRNA相对表达量降低(P<0.05)。与NPDR组比较,PDR组FBG、HbA1c、VEGF水平升高,血清miR-20a-5p mRNA相对表达量降低(P<0.05)。DR患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量与FBG、HbA1c、VEGF水平呈负相关(r=-0611、-0.799和-0.545,均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,血清miR-20a-5p高水平[O^R=0.254(95%CI:0.154,0.596)]为DR发生的独立保护因素,糖尿病病程长[O^R=2.042(95%CI:1.422,2.933)]、血清HbA1c高水平[O^R=2.307(95%CI:1.101,4.833)]、血清VEGF高水平[O^R=2.570(95%CI:1.584,4.144)]为DR发生的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线显示,血清miR-20a-5p预测DR发生敏感性为97.56%(95%CI:0.915,0.997)、特异性为61.54%(95%CI:0.471,0.748);血清VEGF敏感性为57.32%(95%CI:0.447,0.683)、特异性为96.15%(95%CI:0.868,0.995);联合预测敏感性为91.46%(95%CI:0.832,0.965)、特异性为76.92%(95%CI:0.632,0.875)。结论DR患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量降低,与FBG、HbA1c、VEGF水平密切相关,miR-20a-5p可能通过调控糖代谢和VEGF介导DR发生和发展。

MicroRNA-20a对胃癌细胞生长与迁移的影响及其机制

目的:探讨microRNA-20a(miR-20a)对胃癌细胞的生长和迁移的影响及其相关分子机制。方法:通过qRT-PCR方法检测正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cell 1,GES-1)和胃癌细胞系MKN45,SGC7901和NUGC-3中miR-20a的相对表达水平;选取SGC7901细胞为代表,MTT法和克隆形成能力实验评估miR-20a mimic和inhibitor对细胞生长能力的影响;Transwell实验观察miR-20a的mimic和inhibitor对细胞迁移能力的影响;qRT-PCR检测miR-20a靶基因早期生长反应蛋白2(early growth reactive protein 2,EGR2)在mRNA水平的表达。结果:MiR-20a在胃癌细胞中的表达量较GES-1细胞显著增加;MTT实验、克隆形成实验和Transwell实验显示miR-20a mimic促进SGC7901细胞的生长和迁移,而miR-20a inhibitor抑制生长和迁移。MiR-20a mimic抑制EGR2 mRNA表达,而miR-20a inhibitor促进EGR2 mRNA表达。结论:MiR-20a可促进胃癌细胞生长和迁移能力,其分子机制可能与下调EGR2 mRNA的表达相关。

多发性骨髓瘤患者外周血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平的检测及其临床意义

目的:检测多发性骨髓瘤(MM)患者外周血血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平,探讨microRNA-181a和microRNA-20a在MM发病过程中的临床意义。方法:选取2013年1月—2014年5月西安交通大学第一附属医院血液科住院患者作为病例组研究对象,其中MM组32例,其他血液病组12例,所有研究对象均符合《血液病诊断和疗效标准》中诊断标准且均经临床医师确诊,并排除心、肺、肝脏等其他器官衰竭且病情稳定者。同时选取同期20名健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象的外周血标本,采用实时荧光定量PCR方法检测血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达情况,同步检测血清β2微球蛋白(β2-MG)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性、白蛋白(ALB)水平、游离轻链(FLC)水平及M蛋白百分比,并比较其差异。结果:MM组、其他血液病组和正常对照组研究对象血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平分别为0.0452和5.879、0.000和0.072、0.004和1.159,3组间比较差异有统计学意义(H=15.218,9.891;P=0.000,0.007)。MM组患者血清中microRNA-181a和microRNA-20a表达水平与正常对照组比较差异有统计学意义(Z=-2.702,-1.979;P=0.005,0.048),MM组与其他血液病组比较差异也有统计学意义(Z=-3.163,-2.722;P=0.001,0.005);microRNA-181a和microRNA-20a表达水平均与M蛋白百分比呈正相关关系(r=0.574,0.739;P=0.032,0.003);miR-181a表达水平与肿瘤负荷指标β2-MG和FLC呈正相关关系(r=0.552,0.780;P=0.041,0.001)。结论:MM患者血清中microRNA-181a和microRNA-20a高表达,其可能参与MM的发病过程,有望成为MM诊断标志物;其中microRNA-181a可能作为判断MM患者预后不良的指标。

血清中microRNA 20a与小儿肺炎炎症反应进展的相关性研究

目的分析血清中microRNA 20a与小儿肺炎炎症反应进展的相关性,为临床治疗提供依据。方法筛选2015年3月-2017年2月治疗的90例诊断为'肺炎'的患儿设为小儿肺炎组(n=90),另选同期健康体检儿童90例设为对照组(n=90)。儿童入院后均分别进行血常规和血沉等的检查;用酶联免疫吸附测定法(ELISA)识别肺炎的特异性抗体;采用全自动特定蛋白分析仪和免疫比浊法对血清中C反应蛋白(CRP)和类风湿因子(RF)浓度进行定量检测;使用TRIzol试剂分离总RNA,按照Prime-Script RT试剂盒说明将血清中microRNA 20a合成逆转录cDNA;通过10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质提取物,并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上进行血清中microRNA 20a蛋白的表达,采用Kolmogorov-Smirnov检验分析血清中microRNA 20a表达与小儿肺炎的炎症反应的相关性。结果与对照组相比,小儿肺炎组血清中血清免疫球蛋白IgG、IgA水平升高,IgM无显著变化。特定蛋白分析显示小儿肺炎组血清CRP、RF和IL-17含量,microRNA 20a的表达均高于对照组(P<0.05)。microRNA 20a参数与IL-17水平呈显著正相关(r=0.571,P=0.002)。结论血清中microRNA 20a表达可能与肺炎炎症的发病过程有关,microRNA 20a将有望成为诊断小儿肺炎的标志物,可作为判断小儿肺炎患者预后不良的指标。

LncRNA XIST通过miR-20a-5p/HMGA2轴调控乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制

目的 探讨LncRNA XIST对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响及机制。方法 选取正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和Bcap-37细胞,将不同物质转染至MCF-7、T47D细胞,设为空白组(无转染)、si-XIST组(转染si-XIST)、si-NC组(转染si-NC)、微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)组(转染miR-20a-5p mimics)及miR-NC组(转染miR-NC)。CCK-8检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;TUNEL染色检测细胞凋亡。采用荧光素酶报告基因实验验证LncRNA XIST与miR-20a-5p及miR-20a-5p与高迁移率族蛋白A2(HMGA2)的靶向关系。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA XIST、miR-20a-5p的表达水平。采用Western blot检测HMGA2的表达水平。结果 与MCF-10A细胞比较,MCF-7、T47D和Bcap-37细胞中LncRNA XIST表达水平升高,miR-20a-5p表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。下调LncRNA XIST或上调miR-20a-5p抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移,促进细胞凋亡(P<0.05)。LncRNA XIST负性调控miR-20a-5p, miR-20a-5p负性调控HMGA2。结论 下调LncRNA XIST通过miR-20a-5p/HMGA2轴抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。

血清microRNA-184和microRNA-20a联合检测对胃癌的诊断价值

目的探讨血清microRNA-184(miR-184)和microRNA-20a(miR-20a)联合检测对胃癌诊断的临床价值。方法分别选取孝感中心医院332例及368例经病理确诊为慢性胃炎和胃癌的患者。采用荧光定量PCR检测所有患者血清miR-20a与miR-184的表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价2种miRNA诊断胃癌的效能。根据ROC曲线确定这2种miRNA诊断胃癌的阈值,计算敏感性和特异性,并对比癌胚抗原(CEA)的测定结果。结果慢性胃炎组患者血清miR-20a水平较胃癌组患者低(P<0.05);慢性胃炎组患者血清miR-184水平较胃癌组患者高(P<0.05)。临床病理特征中,胃癌患者血清miR-20a表达水平与临床分期、淋巴结转移、饮酒史、年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05);胃癌患者血清miR-184表达水平与患者淋巴结转移、饮酒史、年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05),与肿瘤临床分期有差异(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,血清miR-20a[OR=1.012(95%CI:1.697,6.875)]、miR-184[OR=2.056(95%CI:0.417,0.722)]表达水平与胃癌的发生相关(P<0.05)。经ROC曲线分析表明,诊断胃癌采用血清miR-20a的临界值为4.24,曲线下面积(AUC)为0.762,特异性为71.7%,敏感性为79.4%;miR-184临界值为10.35,AUC为0.861,特异性为82.8%,敏感性为88.4%;CEA临界值为6 mg/ml,AUC为0.740,特异性为71.4%,敏感性为69.3%;血清miR-20a、miR-184联合诊断胃癌的AUC为0.908,特异性为87.6%,敏感性为84.7%。血清miR-184和miR-20a联合诊断胃癌的AUC、特异性及敏感性较3种单一检测方法大或高。结论采用血清miR-20a和miR-184联合检测方法诊断胃癌,临床具有一定的应用价值。

血清微小RNA-20a-5p、微小RNA-128-3p与缺氧缺血性脑病患儿脑神经发育的关系

目的分析微小RNA(miR)-20a-5p、miR-128-3p在缺氧缺血性脑病(HIE)早产儿血清中的表达与脑神经发育的关系。方法选取95例HIE早产儿为HIE组,根据HIE早产儿病情严重程度,将其分为轻度组(n=27)、中度组(n=46)、重度组(n=22);另选取同期95例无HIE早产儿为对照组。评估2组早产儿Apgar评分和新生儿神经行为测定评分法(NBNA)评分;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清中miR-20a-5p和miR-128-3p表达水平;Spearman法分析血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平与Apgar评分、NBNA评分的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平对早产儿发生HIE的诊断价值。结果与对照组相比,HIE组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平升高,Apgar评分、NBNA评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。轻度组、中度组、重度组血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平依次升高,Apgar评分、NBNA评分依次降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman法分析结果显示,血清miR-20a-5p水平与Apgar评分、NBNA评分呈负相关(r=-0.659、-0.548,P均<0.001),血清miR-128-3p水平与Apgar评分、NBNA评分呈负相关(r=-0.582、-0.499,P均<0.001)。血清miR-20a-5p、miR-128-3p联合预测早产儿发生HIE的曲线下面积(AUC)为0.920,敏感度为78.95%,特异度为97.89%。二者联合对早产儿发生HIE的预测效能优于miR-20a-5p、miR-128-3p单独预测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HIE早产儿血清miR-20a-5p、miR-128-3p水平升高,且与病情严重程度和脑神经发育密切相关。miR-20a-5p、miR-128-3p联合检测对早产儿HIE发生有较好的预测价值。

人肝癌细胞系中miR-20a-5p的表达及对肝癌细胞Bel-7402增殖及凋亡的影响

目的探讨miR-20a-5p在人肝癌细胞系中表达及其对肝癌细胞Bel-7402增殖及凋亡的影响。方法通过反转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)考察miR-20a在肝细胞L-02和7种肝癌细胞中的表达;构建过表达或沉默miR-20a-5p的人肝癌Bel-7402细胞株;通过噻唑蓝(MTT)实验考察过表达或沉默miR-20a-5p后对细胞增殖的影响;通过AnnexinV-FITC/PI流式实验考察对细胞凋亡的影响,并进一步通过蛋白质免疫印迹试验考察对凋亡相关基因蛋白表达水平的影响。结果与人肝细胞L-02相比,6种细胞系的miR-20a-5p表达水平较低。过表达miR-20a-5p后细胞增殖能力显著下降(P=0.011),沉默后显著上升(P=0.007)。高表达miR-20a-5p后细胞凋亡和早期凋亡比例均显著增加(P=0.009、0.017),沉默miR-20a-5p均明显降低(P=0.012、0.007)。高表达miR-20a-5p后细胞中凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin、Bcl-2表达下调,凋亡促进蛋白Bax表达上调;沉默miR-20a-5p后XIAP、Survivin、Bcl-2表达上调,Bax表达下调。结论 miR-20a-5p在6种肝癌细胞中低表达,可促进肝癌细胞Bel-7402凋亡,抑制细胞增殖能力。

肺癌与癌旁组织中miR-20a的定量检测及其意义

目的探讨人肺癌与癌旁组织miR-20a定量检测的临床意义。方法 real-timePCR检测31例肺癌及其对应癌旁组织中miR-20a的表达量,分析其与肺癌组织学类型、临床分期、分化程度等临床病理特征的关系。结果肺癌组织miR-20a表达量(2-△△Ct)为3.630(1.042～7.727),与对应癌旁组织相比,有显著性差异(P<0.05)。miR-20a与肺癌临床分期、分化程度、病理类型、肿块大小和淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。结论 miR-20a在肺癌组织高表达,可能与肺癌的发生有关。

miRNA-20a作为CHO-K1细胞抗凋亡调控靶标的研究

通过分析miRNA表达谱发现,miRNA-20a在凋亡CHO-K1细胞中的表达降低。通过构建稳定表达miRNA-20a的重组细胞株,分析该重组细胞的抗凋亡能力。分别构建携带miRNA-20a前体序列或反义序列的重组慢病毒,转染CHO-K1细胞,得到miRNA-20a功能获得或功能抑制的重组细胞。无血清过度消耗培养液应激环境下培养重组细胞,分析靶基因E2F1的表达水平,通过细胞活力和Caspase3/7活性分析评价细胞的抗凋亡能力。结果显示,miRNA-20a过表达的细胞株,E2F1的表达受到显著抑制,在无血清过度消耗的应激环境下,细胞活力显著提高,Caspase3/7活性降低。相反,miRNA-20a抑制表达的细胞株中,E2F1表达增加,而细胞活性显著降低,抗凋亡能力显著下降。上述结果提示,miRNA-20a有望作为哺乳动物宿主细胞的遗传重构靶标,构建耐受应激环境的抗凋亡细胞。

miR-20a-5p调节VEGF通路在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的作用机制

目的探讨微小RNA(miR)-20a-5p调节血管内皮生长因子(VEGF)通路在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠中的作用机制。方法实验分为正常组、模型组、高氧对照组、miR-20a-5p高表达组,每组24只。除正常组外,其余组小鼠在出生后第7天置于氧浓度(75.00±2.00)%氧箱中建立OIR小鼠模型,连续高氧环境5 d后置于常氧中饲养。高氧环境结束前1 d,高氧对照组玻璃体腔内注射1μL磷酸缓冲盐溶液(PBS),miR-20a-5p高表达组玻璃体腔内注射1μL miR-20a-5p激动剂(miR-20a-5p agomir)(1μmol/L),模型组不进行任何处理。正常组一直置于空气中正常饲养。高氧结束后各组小鼠正常空气再饲养5 d进行实验。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测视网膜组织miR-20a-5p、VEGF、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1、VEGFR-2表达情况;视网膜铺片观察视网膜血管形态;苏木精-伊红(HE)染色计数视网膜新生血管内皮细胞核情况;免疫组化检测视网膜组织中VEGF阳性细胞情况。结果模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回、不规则扩张,出现大量新生血管,且新生血管结构及分布紊乱,周边毛细血管网闭塞;miR-20a-5p高表达组相较模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回不明显,血管不规则扩张现象减轻,新生血管明显减少。与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜组织中miR-20a-5p水平降低(P<0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA表达水平升高(P<0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p高表达组视网膜组织中miR-20a-5p水平升高(P<0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA表达水平降低(P <0.05)。结论升高miR-20a-5p可抑制VEGF通路从而减少OIR小鼠视网膜血管新生,实现对OIR小鼠视网膜的保护。

miR-20a-5p靶向调控BRMS1L对人结直肠癌细胞株SW480增殖、凋亡能力的影响及其机制探讨

目的观察微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)靶向调控乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1L)对人结直肠癌细胞株SW480增殖、凋亡能力的影响,并探讨其可能机制。方法取SW480细胞,分别将miR-20a-5p抑制物(anti-miR-20a-5p)、miR-20a-5p抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、BRMS1L过表达载体(pcDNA-BRMS1L)、BRMS1L过表达载体阴性对照(pcDNA-NC)、miR-20a-5p模拟物(miR-20a-5p mimics)、miR-20a-5p模拟物阴性对照(miR-NC)转染至细胞中,CCK-8法测算细胞存活率,流式细胞术测算细胞凋亡率,Western blotting法检测细胞周期素D1(CyclinD1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)、β-catenin蛋白。取SW480细胞,分别将miR-20a-5p mimics、miR-NC与WT-BRMS1L或MUT-BRMS1L共转染至细胞中,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞荧光素酶活性;另取SW480细胞,分别将miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC分别转染至细胞中,采用Western blotting法检测细胞BRMS1L蛋白。结果抑制miR-20a-5p表达或过表达pcDNA-BRMS1L,SW480细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,CyclinD1蛋白表达降低,Cleaved-Caspase-3蛋白表达升高(P均<0.05);抑制BRMS1L表达部分逆转anti-miR-20a-5p对SW480细胞增殖和凋亡的影响(P均<0.05)。抑制miR-20a-5p表达后SW480细胞中β-catenin蛋白的表达较低,抑制BRMS1L表达部分逆转anti-miR-20a-5p对β-catenin蛋白表达的影响(P均<0.05)。miR-20a-5p靶向BRMS1L,并负性调控其表达(P均<0.05)。结论miR-20a-5p靶向调控BRMS1L抑制SW480细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与抑制β-catenin蛋白表达有关。

微小RNA-20a对宫颈癌细胞迁移、侵袭、增殖及ATG7表达的影响

目的探讨微小RNA-20a(miR-20a)对宫颈癌Si Ha细胞迁移、侵袭和增殖的影响及可能机制。方法采用Lipofectamine 2000脂质体法将miR-20a抑制剂和阴性对照载体分别转染Si Ha细胞株。采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测两组细胞中miR-20a的表达以验证转染效果,细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验及MTT法分别检测miR-20a的表达抑制对Si Ha细胞迁移、侵袭和增殖的影响;荧光素酶报告实验及Western blotting验证miR-20a对下游预测靶基因自噬相关蛋白7(ATG7)的调控作用。结果 QPCR检测结果显示,与阴性对照组比较,miR-20a抑制剂组Si Ha细胞中miR-20a的表达量显著降低(P<0.01),证明转染模型构建成功。细胞迁移实验显示,转染48 h后,阴性对照组细胞的划痕愈合率为(75.68±5.94)%,高于抑制剂组的(38.24±7.68)%(P<0.01)。Transwell细胞侵袭实验显示,转染48 h后,阴性对照组穿膜细胞数为(96.35±10.23)个,多于抑制剂组的(23.54±7.26)个(P<0.01)。MTT法检测显示,阴性对照组和抑制剂组细胞增殖能力的差异无统计学意义(P>0.05)。与阴性对照组相比,转染miR-20a模拟物+ATG7野生型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性显著下降(P<0.01),而转染miR-20a模拟物+ATG7突变型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05);Western blotting检测显示,与阴性对照组比较,抑制剂组细胞ATG7蛋白表达量显著增加(P<0.01)。结论降低miR-20a的表达能显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,但细胞增殖能力不受影响,这可能与miR-20a直接作用于其下游靶基因ATG7并调控其表达紧密相关。

MiR-20a在胃癌中的作用及其诊断价值探讨

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,早期诊断和早期干预是改善胃癌患者预后的关键。MiR-20a在胃癌患者癌组织、循环血液以及胃癌细胞株中的表达均明显上调,并与肿瘤临床病理特征和预后密切相关。MiR-20a可通过多种机制促进胃癌细胞增殖,调控胃癌干细胞自我更新,诱导化疗耐药产生。血清/血浆miR-20a单独或与其他miRNAs联合检测有助于胃癌的早期诊断以及疾病进展、复发和预后的预测,有可能成为新的非侵入性胃癌生物学标记物。

Nfic基因3′UTR双荧光素酶报告质粒的构建及其与miR-20a靶向关系的验证

目的构建核因子C(nuclear factor I-C,Nfic)基因3′非编码区(3′UTR)荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶报告基因验证micro RNA-20a(miR-20a)与其潜在靶基因Nfic的靶向关系。方法通过micro RNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-20a与Nfic基因3′UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出Nfic基因3′UTR序列,将此序列克隆至荧光素酶报告载体p MIR-Report Luciferase;将重组荧光素酶报告质粒与miR-20a mimics(实验组)或NCmimics(对照组)共同转染293-AD细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测2组细胞的荧光素酶活性,从而对Nfic与miR-20a的靶向调节关系进行鉴定。将miR-20a mimics和NC mimics分别转染骨髓基质细胞系ST2,裂解细胞提取蛋白后采用Western blotting检测NFIC蛋白的表达水平。结果构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。双荧光素酶报告基因检测显示,与对照组相比,miR-20a可以抑制Nfic 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性(P<0.05);Western blotting结果显示,与对照组相比,ST2细胞转染miR-20a mimics后NFIC蛋白表达水平明显下调。结论成功构建了Nfic基因3′UTR荧光素酶报告质粒,而miR-20a可以直接作用于Nfic基因3′UTR,抑制其荧光素酶活性。