MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

构建人m ir-218-2,pre-m iRNA慢病毒表达载体,为研究m iR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-m ir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体。PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内m iR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高m iR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-m ir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高m iR-218的表达。为进一步研究m iR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。

沉默微小RNA-218表达保护STZ诱导的糖尿病大鼠肾组织

目的:探讨沉默微小RNA-218(microRNA-218,miR-218)表达对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病肾病大鼠肾脏组织的保护作用及其可能机制。方法:采用单次腹腔注射STZ(50 mg/kg)方法制备糖尿病大鼠模型并构建miR-218短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。SD大鼠被随机分为健康对照组、糖尿病模型组、空载慢病毒组及miR-218-shRNA组。于自动生化仪上检测不同时点(4、8和12周)大鼠血糖、24h尿蛋白量、血清肌酐(serum creatinine,SCr)及血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量。实时荧光定量PCR(RTqPCR)检测肾脏组织miR-218的表达。RT-qPCR和Western blot检测血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)、肾病蛋白(nephrin)和p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)的mRNA及蛋白表达水平。Caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测肾脏组织细胞凋亡。结果:与健康对照组相比,STZ处理后大鼠miR-218表达水平显著升高。同时模型大鼠的血糖、24 h尿蛋白量、SCr及BUN含量显著升高(P<0.05);模型大鼠肾脏组织中HO-1和nephrin的mRNA和蛋白表达水平显著降低,而p38 MAPK蛋白的磷酸化水平显著升高;另外,模型大鼠肾脏组织中的caspase-3活性也显著升高。模型大鼠感染miR-218-shRNA后,miR-218表达水平显著下降并可以显著逆转上述效应。miR-218-shRNA组肾脏组织细胞的凋亡水平显著低于糖尿病模型组及空载慢病毒组。结论:miR-218参与了糖尿病大鼠的肾脏损伤,慢病毒载体沉默其表达能有效抑制肾脏组织细胞的凋亡,提示miR-218可以作为糖尿病肾病的基因治疗靶点。