基于上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测

基于Na YF_(4):Yb^(3+),Tm^(3+)@Na YF_4上转换纳米颗粒(Upconversion nanoparticles,UCNPs)和DNA催化发夹组装(Catalytic hairpin reaction,CHA)技术构建近红外激发(Near-infrared,NIR)荧光生物传感器,用于micro RNA的高灵敏分析。靶标micro RNA-21(mi RNA-21)可与磁珠(Magnetic beads,MBs)表面修饰的发夹H1发生toehold区域介导的链取代反应,发夹H1暴露新的toehold区域与UCNPs表面修饰的发夹H2发生反应,形成H1/H2复合物,同时mi RNA-21被取代并与新的发夹H1反应,此过程将UCNPs固定于MBs表面,而且实现了信号的循环放大。接下来通过磁分离技术,将固定于MBs表面的UCNPs分离出来,在808 nm NIR的激发下产生上转换发光(Upconversion luminescence,UCL),对mi RNA-21的检测范围为0.1~100 nmol/L,检出限为11.3 pmol/L。此外,该荧光生物传感器成功应用于血清样本中mi RNA-21的分析,表明其具有良好的实用性。

MicroRNA检测方法研究进展

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的单链非编码小RNA,在机体中通过诱导mRNA降解或调节蛋白质水平调控基因表达。研究表明,miRNA的异常表达与多种人类疾病密切相关,可作为早期诊断和疾病筛查理想的生物标志物,因此,实现miRNA早期精准检测在临床诊断和医学研究中具有重要意义。本文围绕传统检测方法与新型miRNA生物传感器两方面,总结了miRNA检测方法的研究成果,并提出了未来的发展趋势。

MicroRNA检测方法的发展现状

MicroRNA是内源性的非编码的小RNA,参与调控多种生理学和病理学的过程,如细胞分化、细胞增殖和肿瘤形成。近年来,对miRNAs的研究逐渐深入,而研究miRNAs的前提是首先对其检测鉴定。由于miRNAs序列很短、家族成员序列类似且存在多种成熟形式,对其进行检测甚至定量均是一种挑战,为了更好地检测miRNAs,各种新的检测鉴定miRNAs的方法相继报道。本文综合近几年的发展现状,介绍了几种高通量筛选miRNAs、鉴定和定量miRNAs的方法。

胸水microRNA检测及与生化指标、肿瘤标志物的相关性

目的:分析良恶性胸水中与肿瘤密切相关的5种micro RNA的表达,探讨其与胸水中生化指标和肿瘤标志物的相关性。方法:应用逆转录荧光定量PCR法对12例肺癌性和9例良性患者的胸水中has-let-7b、has-mi R-24、has-mi R-27b、has-mi R-30d和has-mi R-128a的表达量进行检测,并分析其与胸水中腺苷脱氨酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)、总蛋白(TP)、葡萄糖(GLU)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)、甲胎蛋白(AFP)的含量之间的关系。结果:5种micro RNA中只有has-mi R-24在恶性胸水中表达要明显低于良性胸水(P<0.05),与ADA和LDH的相关性分别是0.5707和0.5144;ADA与LDH的含量也是恶性胸水明显低于良性胸水(P<0.05),ADA与LDH在恶性胸水中的含量的相关性达到0.7754。结论:恶性胸水中has-mi R-24的表达与ADA和LDH的含量存在明显的相关性,为进一步探究micro RNA在恶性胸水形成中所起作用提供依据。

microRNA检测方法的研究进展

microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸(nt)的内源性非编码小分子单链RNA,通过下调蛋白编码基因的表达,对不同的生理和病理过程起重要的调控作用。准确而灵敏地检测组织或细胞中miRNA的表达水平,可为研究其功能鉴定和作用机制提供帮助。本文就近年来有关miRNA检测方法的研究进展作一综述。

血清/血浆microRNA检测方法探讨与建立

目的:观察实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆microRNA表达水平的影响因素。方法:从样本来源、抗凝剂选择、样本储存时间等方面探讨实时荧光定量PCR技术检测血清/血浆miRNA表达的影响因素。结果:miRNA表达在血清和血浆中没有明显差异,样本储存时间对miRNA的表达没有明显影响,但使用肝素抗凝会明显抑制miRNA的表达。结论:成功建立了一套标准化的血清/血浆miRNA表达检测方法。

循环microRNA检测在骨质疏松发生中的研究进展

骨质疏松是最常见的与年龄相关的骨类疾病,常常无临床症状,一般骨折发生后才被确诊。通过骨密度和常规骨标志物很难评估骨质疏松患者骨质量及预测骨折风险。microRNA (miRNA)可以调控参与骨重构的成骨细胞和破骨细胞的分化及活性。研究发现绝经后妇女血清及骨组织中miRNA存在差异表达,提示miRNA一方面在骨重构中发挥重要作用,另一方面参与绝经后妇女骨质疏松的发生。本文就miRNA在骨质疏松及其骨折患者中调控作用的最新研究进行综述,并讨论循环miRNA作为骨质疏松新型生物标志物的可能。

microRNA检测方法的优缺点评价

microRNA是由Lee等在1993年首次报道存在的,他们对线虫体进行了全基因组扫描研究,以此来寻找对秀丽隐杆线虫的幼虫起重要作用的基因。最后发现线虫的发育出现障碍是由于一种被命名为lin-4的基因发生了变异。但是这项发现在当时并没有被人们引起足够的重视。直到2000年,Reinhart等在线虫研究中报道了第二种被发现的microRNA分子let-7microRNA，这才引起了人们的密切关注。此后，上万种不同的microRNA分子在植物、动物和病毒中被发现，其中在人类细胞中也发现了2000多种，所占人类基因组的比重是1％，调控着体内30％的基因表达。

MicroRNA检测与膀胱癌的诊断及治疗

MicroRNA（miRNAs）是一类长约22-25个核苷酸序列组成的非蛋白编码的内源性RNA。它通过调控相关靶基因的表达,起到原癌基因或抑癌基因作用,参与真核生物的多种生理和病理过程,如个体发育、细胞分化、肿瘤增殖与凋亡等。经过大量研究发现，miRNAs与肿瘤的发生发展有明显相关性，其作用机制的研究是当前热点之一．这些研究已取得进展。现就当前miRNAs在膀胱癌中的研究进展作一综述。

高通量SPRI技术与microRNA检测

miRNA是一种内源性小分子非编码RNA,含19-23个核苷酸,通过与mRNA的3＇非编码区结合从而阻断翻译,调节植物或动物的基因表达,并在细胞发育过程中包括细胞裂解、增殖、凋亡及诱导疾病发挥重要的作用.因此,miRNA迅速成为生命科学研究的新领域.而检测miRNA的表达是研究miRNA功能的第一步.表面等离子体共振成像（surface plasmon resonance imaging,SPRI）技术是一种基于光学原理的传感检测技术,它利用表面等离子体共振原理,可将生物分子相互作用或生化反应的信号转化成光信号进行传感,具有无需标记、实时检测、快速、高通量检测等优点,在miRNA的检测上将显示出巨大的发展潜力和应用价值.本文对目前miRNA的检测方法,以及高通量SPRI技术在miRNA检测中的应用发展趋势做一综述.

无酶信号放大技术在MicroRNA检测中的应用进展

无酶的信号放大技术普遍存在于生物传感器中,因为其具有成本低、抗干扰能力强、容易进行设计等优点,被广泛应用于DNA检测、RNA检测以及蛋白检测等领域,尤其是与多种癌症或者其他疾病密切相关的MicroRNAs,能否准确的定量检测显得极为重要。该文章对DNA生物传感器中无酶的信号放大方法进行了分类,并分别介绍了各类方法对MicroRNA检测的应用进展。

不同抗凝处理对心梗后循环microRNA检测影响的研究

目的比较不同抗凝(EDTA抗凝、枸橼酸钠抗凝、不抗凝)所获得的血浆或血清对心梗后循环microRNA(miRNA)检测的影响。方法分别提取不同抗凝剂处理的胸痛6小时内的心梗患者和健康人的血样中的循环miR-NA,利用TaqMan qRT-PCR方法分别检测EDTA抗凝血浆、枸橼酸钠抗凝血浆,以及血清中的miR-1、miR-133a的含量。结果心梗患者血浆和血清中都能有效检测miR-1和miR-133a的浓度。ROC曲线显示,EDTA血浆中的miR-1的AUC为0.885,miR-133a的AUC为0.797,高于血清及枸橼酸钠抗凝血浆中miR-1和miR-133a的AUC。结论 EDTA抗凝的血浆是检测心梗后miR-1和miR-133a含量的理想样本,其中miR-1在诊断心梗方面具有更好的特异性和灵敏性。

microRNA检测方法的研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一组小的非编码单链RNA,它们在生物进化过程中起到很重要的作用。准确并且灵敏地检测出miRNA的表达量,能够帮助揭开它们在生物功能中的神秘面纱。但是对于miRNA检测却一直比较困难,由于成熟的miRNA非常短,并且它们在细胞中的表达量不高,这些特点给传统的检测带来很大的挑战。文章综述了近年来有关miRNA检测方法的研究进展,并对miRNA检测领域国内外研究现状及前景进行了评述。

新一代测序技术应用于microRNA检测

MicroRNAs（miRNAs）是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA（~22nt）,在基因转录后调控中发挥至关重要的作用。越来越多的证据表明,miRNAs参与很多重要的生理和病理过程,例如发育、器官形成、调亡、细胞增殖、肿瘤发生等。近年来飞速发展的新一代测序技术在miRNA检测方面具有重要的应用。文章简要介绍了新一代测序技术3大平台的基本步骤和原理,测序数据的生物信息学分析方法以及新一代测序技术在miRNA方向的主要应用。相比于传统的miRNA检测方法,新一代测序技术具有通量高、对遗传物质检测完全且准确度高,可重复性好等优点,在探索新miRNA、miRNA互补链、miRNA编辑、miRNA异构体检测以及miRNA靶基因检测等方面具有巨大优势。随着新一代测序技术的不断发展,测序成本不断降低,在未来几年,新一代测序技术的使用率或将大大增加。新一代测序技术的不断应用将进一步促进人类对于miRNA在各种生理病理过程中的功能和调控的认识。

莱茵衣藻硫胁迫相关microRNA检测及其靶基因分析

采用特异反转录引物,构建莱茵衣藻microRNA(miRNA)的cDNA文库.选用U4核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)作为内参,用SYBR green RT-PCR对3种与莱茵衣藻缺硫胁迫反应相关的miRNA进行检测,利用在线平台软件Web MicroRNAs Designer(WMD3)对miRNA靶基因进行预测.结果表明,在缺硫胁迫下,3种miRNA(miRNA1145.2、miRNA1146和miRNA1158)的表达水平均明显上调,与正常培养的莱茵衣藻表达miRNA的相对丰度比值分别为3.11、2.38和3.67.靶基因预测分析表明,miRNA1145.2能影响脂肪酸氧化反应,miRNA1146与辅酶Q代谢相关,miRNA1158可能参与磷酸戊糖途径调控.

果树MicroRNA检测技术研究进展

微RNA(MicroRNAs,miRNA)是一类广泛存在于真核生物中具有调控功能的内源性非编码RNA分子,miRNA表达谱系的差异与各种各样的生物调节途径有关。对目前果树miRNA研究中常见的检测方法——Northern blotting检测、ISH检测、miRNA芯片检测、测序检测和基于RT-PCR的检测做一简单介绍。

循环microRNA检测在大鼠溃疡性结肠炎诊断及疗效监测中的意义

目的探索并建立一种基于循环micro RNA的诊断大鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)方法并监测其治疗后效果的临床前策略。方法第1阶段:硫酸葡聚糖(Dextran sulfate sodium,DSS)诱导大鼠UC模型。实时定量RT-PCR筛选差异性的血清micro RNA。ELISA检测血清核周抗中性粒细胞胞浆抗体(periunclear antineutrophil cytoplasmic antibodies,p ANCA)。Logistic回归法建立诊断模型Indice。受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线评价指标的诊断效能。第2阶段:验证指标对UC的诊断效能,并用其评价UC的疗效。结果第1阶段:大鼠UC模型建立成功。Mi R-20b、mi R-21和let-7e*在UC大鼠血清中高表达,mi R-125b-1*无明显变化。p ANCA在UC大鼠血清中高表达。诊断模型Indice=0+(2.645×mi R-20b)+(1.622×mi R21)+(0.979×let-7e*)+(0.082×p ANCA)的诊断效能强于各单项指标。第2阶段:各指标均能监测UC疗效,Indice的监测效能最强。结论循环micro RNA能稳定高效的诊断UC并监测其治疗后效果。

电化学生物传感器在microRNA检测中的应用

MicroRNA(miRNA)是一种内源性的单链非编码RNA,参与细胞的增殖凋亡分化和代谢等重要生理过程。近年来发现循环miRNA能够耐受RNA酶消化、强酸强碱、煮沸等极端条件,是一种潜在的疾病标志物。因此,miRNA的检测对疾病的早期诊断具有重要的生物学意义。电化学生物传感器由于其简易、便携、灵敏、反应快速以及价格低廉等特点而被研究者广泛应用于mi RNA检测的研究。本文综述了miRNA的电化学传感器的研究进展,评述了各类方法的优缺点,并对mi RNA电化学检测的发展趋势进行了展望。

基于无标记荧光共振能量转移的microRNA检测方法研究

利用以阳离子共轭聚合物为能量供体的荧光共振能量转移(FRET)策略和滚环扩增放大技术,建立了一种新型的microRNA(miRNA)检测方法。阳离子共轭聚合物采用聚[(9,9-双(6’-N,N,N-三乙基铵)己基)亚芴基亚苯基二溴化物](PFP)。PFP是一种由大量吸光单元共轭而成的阳离子聚合物,具有独特的光捕获和荧光增强性能,可以和带有负电荷的DNA通过静电作用相互结合。SG是一种能够结合于所有双链DNA双螺旋小沟区域的染料,其在游离状态下,荧光微弱,但一旦与双链DNA结合后,荧光会大大的增强。首先,设计了一条可与目标分子特异性杂交的锁式探针和与RCA产物序列互补的DNA链。当体系中存在miRNA时,在T4 DNA连接酶作用下,锁式探针连接成环;随后,在phi29 DNA聚合酶和dNTPs共同作用下,在miRNA的3’端滚环扩增出一条与锁式探针序列互补的长单链DNA,所得产物与互补DNA链杂交形成双链DNA(dsDNA)。此时SG作为FRET受体掺入其中,形成SG-dsDNA共同体。随后, SG-dsDNA与PFP因静电相互作用而紧密接近,由于PFP的发射光谱与SG的激发光谱有重叠,因此二者之间可以发生FRET现象。反之,当体系中不存在miRNA时,挂锁探针则无法连接成环,阻止了扩增反应的进行及其产物与互补DNA链的杂交反应。加入SG后,由于SG与单链DNA的结合能力很弱, SG则游离于溶液中,不会与PFP发生有效的FRET。因此目标分子的浓度与体系的FRET效率直接相关。以let 7a作为待测miRNA分子,在0.05~5 nmol·L-1的范围内, let 7a的浓度与从反应体系测得的FRET效率(I520/I423)成正比。同时以无PFP参加的检测方案作为对比实验,证明了PFP确实具有提高灵敏度的作用。另外,以四种同族miRNA分子及两种其他miRNA分子作为干扰物质对方法的特异性进行了考察,发现除了两种与目标分子序列高度相似的物质存在干扰外,其他物质几乎不产生信号。利用该方法对细胞总RNA提取液中let 7a的含量及其加标含量进行了检测,测量所得回收率基本令人满意。所建立的方案不需要荧光标记探针,有效降低了检测成本,简化了操作步骤,在与miRNA相关的疾病诊断领域具有一定的应用前景。

血清microRNA检测在肝细胞癌诊断中的研究进展

随着肝细胞癌(HCC)患病率和病死率的逐渐上升,寻找精确、简便易行而无创的早期诊断标志物越来越重要。小分子RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码的小RNA,广泛存在于动物、植物和病毒中,并且在血清和组织中均稳定表达。介绍了miRNAs作为促癌基因和抑癌基因在肿瘤发生和发展中的作用,总结了多种血清miRNAs在肝细胞癌中的异常表达情况。分析表明可以利用这些稳定表达的miRNAs作为早期诊断肿瘤的无创性标志物。