miR-32-5p通过p53/SLC7A11信号通路介导的铁死亡对甲状腺癌细胞增殖的作用机制

目的探讨miR-32-5p能否通过调节p53/SLC7A11信号通路介导的铁死亡影响甲状腺细胞增殖。方法将TPC-1细胞随机分为Control组、miR-NC组、miR-32-5p组、miR-32-5p+Fer-1组、miR-32-5p+si-p53组、miR-32-5p+Fer-1+si-p53组。RT-PCR检测细胞中miR-32-5p相对表达量;CCK-8法检测细胞增殖;检测细胞中Fe^(2+)、MDA、SOD、GSH及ROS的含量;JC-1法检测细胞中线粒体膜电位水平;蛋白质印迹检测细胞中p53、GPX4、SLC7A11蛋白表达。结果甲状腺癌细胞系BCPAP、TPC-1、SW1736细胞中miR-32-5p相对表达量均低于人正常甲状腺细胞系HT-ori3细胞(P<0.01)。和Control组相比,miR-32-5p组细胞中miR-32-5p相对表达量、细胞中MDA含量、Fe^(2+)含量和ROS荧光强度及细胞中p53蛋白表达明显增加,细胞存活率、细胞中GSH含量和SOD活性、线粒体膜电位水平及细胞中GPX4、SLC7A11蛋白表达明显降低(P<0.01);和miR-32-5p组相比,miR-32-5p+Fer-1组、miR-32-5p+si-p53组和miR-32-5p+Fer-1+si-p53组细胞中miR-32-5p相对表达量、细胞中MDA含量、Fe^(2+)含量和ROS荧光强度及细胞中p53蛋白表达均明显降低,细胞存活率、细胞中GSH含量和SOD活性、线粒体膜电位水平及细胞中GPX4、SLC7A11蛋白表达明显增加(P<0.01);且miR-32-5p+Fer-1+si-p53组细胞中miR-32-5p相对表达量、细胞中MDA含量、Fe^(2+)含量和ROS荧光强度及细胞中p53蛋白表达明显低于miR-32-5p+Fer-1组,细胞存活率、细胞中GSH含量和SOD活性、线粒体膜电位水平及细胞中GPX4、SLC7A11蛋白表达高于miR-32-5p+Fer-1组(P<0.05)。结论过表达miR-32-5p可通过促进铁死亡抑制甲状腺癌何丽琼细胞增殖,其可能和调控p53//SLC7A11信号通路有关。

LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p调控 ITGA6表达对非小细胞肺癌增殖与迁移的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR503HG、微小RNA(miRNAs)-32-5p、整合素α(ITGA)6在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其对NSCLC细胞增殖和迁移的影响。方法 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中提取273例NSCLC患者癌组织及其对应癌旁组织的LncRNA、miRNA及转录组mRNA的芯片数据,R软件中MAX STAT函数包统计分析LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表达。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测80例NSCLC患者癌组织标本和NSCLC细胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6 mRNA表达。双荧光素酶实验证明LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6的关系。依次以LncRNA MIR503HG-mimic-NC、LncRNA MIR503HG-mimic、miR-32-5p-agomir-NC、miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir、LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6、miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6转染H1299细胞,另设定正常(Normal)组细胞。EDU染色实验与Transwell小室实验检测各组细胞体外增殖与转移活性;裸鼠体内皮下种植肿瘤模型检测细胞体内生长与转移能力。Western印迹检测ITGA6、E-钙黏蛋白(cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达。结果 在线分析结果显示,与癌旁组织和BEAS-2B细胞相比,LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA在NSCLC组织和NSCLC细胞表达升高,miR-32-5p mRNA下降,差异具有统计意义(均P<0.05)。双荧光素酶实验证实LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p表达,miR-32-5p靶向ITGA6表达。过表达LncRNA MIR503HG可增强H1299细胞的体外增殖与转移及体内生长与转移能力,ITGA6和Vimentin表达升高,E-cadherin表达降低,miR-32-5p-agomir可部分逆转这一作用,而pcDNA3.1-ITGA6可部分修复这一逆转作用,差异均具有统计意义(P<0.05)。结论 下调LncRNA MIR503HG表达能降低H1299细胞增殖与转移能力,发挥抑癌效应,其机制可能与靶向miR-32-5p调控ITGA6表达水平有关,为NSCLC的治疗提供靶点。

循环外泌体miR-485-3p和miR-32-5p表达与早发冠心病发病的相关性研究

目的分析循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达和早发冠心病发病的相关性。方法回顾性纳入2023年10月至2024年5月确诊为早发冠心病的50例患者作为观察组,另外纳入同期检查排除冠心病诊断的50例健康体检者作为对照组,收集两组基本资料和临床资料,对存在差异的指标采取多元logistic回归模型分析早发冠心病的影响因素,采取Spearman相关分析法分析血浆外泌体miR-485-3p、miR-32-5p水平和早发冠心病发生及Gensini积分的相关性,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评价血浆外泌体miR-485-3p、miR-32-5p单独或联合对早发冠心病的预测价值。结果观察组的冠心病家族史比例、吸烟史比例、低密度脂蛋白(LDL)、miR-485-3p、miR-32-5p及Gensini积分均高于对照组(P<0.05)。存在差异的指标采取多元logistic回归模型分析,发现吸烟史、冠心病家族史、LDL、miR-485-3p、miR-32-5p均为影响早发冠心病发生的主要因素,OR值分别为6.997(95%CI:1.578~31.027)、16.671(95%CI:1.666~166.799)、2.632(95%CI:1.060~6.537)、12.717(95%CI:2.629~61.505)、6.000(95%CI:1.839~19.571)。早发冠心病和循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达呈正相关关系(r=0.525、0.548,P<0.05);早发冠心病Gensini积分和循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p表达也呈正相关关系(r=0.485、0.506,P<0.05)。ROC曲线发现,循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p预测早发冠心病的ROC曲线下面积(AUC)值分别为0.927、0.936,联合预测的AUC值达到0.957。结论循环外泌体miR-485-3p、miR-32-5p在早发冠心病中表达均上调,二者与早发冠心病发病及冠脉病变程度呈正相关,均为疾病发生的影响因素,能当作预测疾病发生的潜在生物标志物,且联合两项指标的预测价值更高。

miR-32-5p和FKBP14基因转染对SPC-A1细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其靶向关系验证

目的观察miR-32-5p和FK506结合蛋白14(FKBP14)基因转染对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系SPC-A1增殖、迁移、侵袭能力的影响,并验证两者之间靶向关系。方法选取SPC-A1细胞,将细胞为A、B、C、D、E、F组,分别转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con,采用MTT法检测细胞吸光度值,并计算细胞存活率;Transwell实验检测细胞迁移数、侵袭数,Western blotting法检测细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量。取SPC-A1细胞,将细胞分为G、H、I、J组,分别转染FKBP14-WT+miR-con、FKBP14-WT+miR-32-5p、FKBP14-MUT+miR-con、FKBP14-MUT+miR-32-5p,采用荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。取SPC-A1细胞,将细胞分为K、L、M、N组,分别转染miR-32-5p、miR-con、anti-miR-32-5p、anti-miR-con,Western blotting法检测细胞中KBP14蛋白相对表达量。结果与B组比较,A组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量增加(P均<0.05);与D组比较,C组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量减少(P均<0.05);与F组比较,E组SPC-A1细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量增加(P均<0.05)。与G组比较,H组细胞荧光素酶活性减弱(P<0.05);与I组比较,J组细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)。与L组比较,K组FKBP14蛋白相对表达量减少(P<0.05);与N组比较,M组FKBP14蛋白相对表达量增加(P<0.05)。结论过表达miR-32-5p或敲减FKBP14后SPC-A1细胞存活率降低,迁移细胞数、侵袭细胞数减少,miR-32-5p与FKBP14存在靶向调控关系。

miR-32-5p靶向NFIL3基因促进脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡和炎性反应

目的探讨miR-32-5p对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡和炎性反应的影响及机制。方法用终浓度为30μg/ml的脂多糖刺激A549细胞为LPS组,以未经任何处理的细胞作为对照(NG)组;设置miR-con组、miR-32-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-32-5p组、LPS+anti-miR-con组、LPS+anti-miR-32-5p组、LPS+pcDNA-con组、LPS+pcDNA-NFIL3组、LPS+anti-miR-32-5p+si-con组、LPS+anti-miR-32-5p+si-NFIL3组,转染均采用脂质体法。qRT-PCR检测miR-32-5p和NFIL3 mRNA表达水平;Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)的表达;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果脂多糖可抑制NFIL3的表达,促进miR-32-5p的表达。miR-32-5p低表达和高表达NFIL3抑制脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡,降低IL-6、TNF-α的水平,抑制cleave-caspase-3的表达。miR-32-5p靶向调控NFIL3的表达,敲减NFIL3可以部分逆转miR-32-5p对脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡和炎性反应的抑制作用。结论miR-32-5p能抑制脂多糖诱导的A549细胞凋亡和炎性反应,其机制与上调NFIL3及抑制炎性因子TNF-α、IL-6的表达有关。

结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2的表达变化及临床意义

目的观察结肠癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)X染色体失活特异性转录本基因(XIST)、微小RNA(miR)-32-5p、基因增强子的人类同源基因(EZH2)的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测86例结肠癌组织和癌旁组织中的lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2,分析lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2表达与患者临床病理特征的关系,采用Pearson线性相关分析三者之间的相关性。结果与癌旁组织相比,结肠癌组织中lncRNA XIST、EZH2表达高,而miR-32-5p表达低(P均<0.05)。结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2表达与肿瘤分期有关(P均<0.05)。结肠癌组织中lncRNA XIST与miR-32-5p的表达呈负相关(r=-0.612,P<0.01),miR-32-5p与EZH2的表达呈负相关(r=-0.608,P<0.01)。结论结肠癌组织中lncRNA XIST、EZH2表达升高,而miR-32-5p表达降低,均与肿瘤分期有关,有可能成为新的结肠癌肿瘤标志物。

Lnc RNA HNF1A-AS1靶向miR-32-5p调控肺癌对顺铂的耐药性

目的探讨长链非编码RNA HNF1A-AS1对顺铂耐药肺癌细胞凋亡、耐药性的影响机制。方法运用MTT法检测顺铂耐药肺癌细胞H520/DDP的IC50。将si-NC组(转染si-NC)、si-HNF1A-AS1组(转染si-HNF1A-AS1)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-32-5p组(转染miR-32-5p mimics)、si-HNF1A-AS1+anti-miR-NC组(共转染si-HNF1A-AS1和anti-miR-NC)和si-HNF1A-AS1+anti-miR-32-5p组(共转染si-HNF1A-AS1和anti-miR-32-5p)均用脂质体法转染至H520/DDP细胞。RT-qPCR实验检测细胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的mRNA的表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果与肺鳞状细胞癌细胞H520相比,H520/DDP细胞的IC50显著升高,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),成功构建顺铂耐药H520细胞;H520/DDP细胞中HNF1A-AS1的表达明显升高,miR-32-5p的表达明显降低(P<0.05);抑制HNF1A-AS1、过表达miR-32-5p均可明显下调H520/DDP细胞的IC50,促进凋亡;miR-32-5p可抑制野生型HNF1A-AS1细胞的荧光活性,并负向调控其表达。抑制miR-32-5p可逆转抑制HNF1A-AS1对H520/DDP细胞的增敏和促凋亡作用。结论长链非编码RNA HNF1A-AS1可通过靶向负调控miR-32-5p的表达调控顺铂耐药肺癌细胞的顺铂敏感性。

miR-32-5p靶向ZEB1、ZEB2基因调控乳腺癌增殖和侵袭能力的机制

目的探讨ZEB1和ZEB2在乳腺癌中的作用及miR-32-5p对乳腺癌调控的分子机制。方法通过Western blot和qRT-PCR检测乳腺癌和癌旁组织中ZEB1、ZEB2和miR-32-5p的表达,筛选出ZEB1和ZEB2高表达的乳腺癌细胞系,采用Western blot和qRT-PCR检测敲减效率。应用克隆形成、迁移和侵袭实验检测敲减ZEB1或ZEB2后对乳腺癌细胞生物学行为的影响,Western blot检测上皮-间质转化相关蛋白(E-cadherin、vimentin)的表达。双荧光素酶报告系统检测miR-32-5p与ZEB1或ZEB23′UTR区域的结合。Western blot、迁移和侵袭实验检测抑制miR-32-5p后对上皮-间质转化相关蛋白、迁移和侵袭的影响。结果乳腺癌组织中ZEB1、ZEB2和miR-32-5p mRNA表达高于癌旁组织。乳腺癌组织中miR-32-5p表达和ZEB1、ZEB2表达呈正相关。MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7三种细胞中,MCF-7细胞ZEB1和ZEB2表达水平较高。敲减ZEB1或ZEB2后,形成的克隆数目减少,迁移和侵袭能力减弱,E-cadherin蛋白表达增加,vimentin蛋白表达降低。ZEB1或ZEB23′UTR区域存在miR-32-5p的结合位点,抑制miR-32-5p会增加迁移和侵袭能力,E-cadherin蛋白表达增加,vimentin蛋白表达降低。增加ZEB1或ZEB2表达会使抑制作用减弱。结论miR-32-5p通过靶向ZEB1和ZEB2调控E-cadherin和vimentin蛋白表达,抑制乳腺癌的增殖、凋亡、迁移和侵袭。

lncRNA XIST通过miR-32-5p/EZH2分子轴调控结直肠癌HCT-8细胞的恶性生物学行为

目的:探讨lncRNA XIST通过miR-32-5p/果蝇Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog2,EZH2)分子轴调控结直肠癌HCT-8细胞的恶性生物学行为。方法:收集2014年7月至2018年8月中南大学湘雅医院直肠肛门外科资料完整的结直肠癌患者28例癌组织和配对的癌旁组织标本,采用qPCR检测结直肠癌组织及细胞系中lncRNA XIST和miR-32-5p的表达水平,双荧光素酶报告基因验证1ncRNA XIST、miR-32-5p和EZH2的靶向关系,并进一步通过WB检测EZH2的表达水平。CCK-8、Transwell及Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测HCT-8细胞增殖、迁移及凋亡情况。结果:lncRNA XIST在结直肠癌组织及细胞系中高表达,且在HCT-8细胞中表达最高(P<0.05或P<0.01)。双荧光素酶报告基因证实,lncRNA XIST靶向负调控miR-32-5p(P<0.05),且EZH2是miR-32-5p的靶基因。敲降1ncRNA XIST抑制HCT-8细胞增殖和迁移并诱导其凋亡(P<0.05或P<0.01);进一步实验证明,敲降lncRNA XIST上调miR-32-5p的表达水平,从而下调EZH2表达水平,进而抑制HCT-8细胞增殖和迁移并诱导其凋亡。结论:lncRNA XIST通过miR-32-5p/EZH2分子轴促进HCT-8细胞增殖、迁移并抑制细胞凋亡。

5-氨基酮戊酸对水稻植株中^(32)P吸收与分配的影响

以两系杂交粳稻鄂粳杂1号为材料,应用32P示踪技术比较研究了在始穗期喷施不同浓度(10 mg/L3、0 mg/L、50 mg/L)的5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid,ALA)对水稻植株中32P吸收与分配的影响。结果表明,105~0 mg/L ALA处理稻株的穗、叶片、茎鞘、根系中的32P比活度和放射性活度均显著高于不喷施ALA的对照处理;105~0mg/L ALA处理使分配到稻株穗部的32P活度百分比显著高于对照,在开花期、乳熟期和腊熟期分别较对照提高了4.3%6~.0%、4.1%5~.0%和2.0%2~.7%。上述结果表明,105~0 mg/L ALA处理能显著提高稻株各器官对磷素的吸收,并能明显促进磷素向穗部的运输分配,从而使105~0 mg/L ALA处理水稻的结实率和产量显著增加,与对照相比,结实率和产量分别提高了4.8%9~.9%和5.4%1~4.9%,其中以30 mg/L ALA处理增产效果最大。

mi R-32-5p通过靶向Dickkopf相关蛋白3的表达调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的生物学行为

目的:通过生物信息学手段筛选乳腺癌中差异表达的关键miRNA及其靶基因,干预其在乳腺癌细胞中的表达并观察对乳腺癌细胞功能的影响。方法:利用GEO数据库筛选在乳腺癌中差异表达的miRNA,ENCORI数据库验证差异miRNA的表达,以选定最显著的差异表达miRNA为研究对象;利用Starbase、miRDB和miRWalk数据库预测miR-32-5p的靶基因,利用DAVID数据库对靶基因进行GO分析和KEGG分析,利用String数据库联合Cytoscape3.6.2软件进行PPI网络分析及核心基因的筛选,从核心基因中选择相互联系紧密"度值"最显著的Dickkopf相关蛋白3(DDK3)基因进行后续实验。qPCR检测miR-32-5p在人正常乳腺细胞MCF10A和人乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-453细胞中的表达。向MDA-MB-231细胞中转染miR-32-5p mimic、miR-32-5p inhibitor及各自的对照(NC)序列,分别用CCK-8法、流式细胞术和Transwell实验检测过表达或抑制miR-32-5p对细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结果:从GEO数据库中获取的两个数据集共识别出两个差异miRNA,ENCORI数据库验证差异miRNA的表达发现miR-32-5p的表达水平与GEO数据库的结果一致,故选择其进行研究;预测得到198个miR-32-5p潜在的靶基因并鉴定出10个核心基因(DKK3、WNT2B、SFRP5、SFRP2、SFRP1、LRP6、WNT6、KREMEN1、NEDD4L、TRIP12),其中DKK3的度值最大可能在乳腺癌中较为重要,于是选择miR-32-5p/DKK3轴进行后续研究。miR-32-5p在3种乳腺癌细胞中的表达水平显著高于正常乳腺细胞(均P<0.01),其中以MDA-MB-231细胞中表达最高。双荧光素酶基因报告实验验证了miR-32-5p与DKK3基因的靶向结合及其对后者表达的负向调控。转染miR-32-5p mimic、miR-32-5p inhibitor后成功提高或抑制了MDA-MB-231细胞中miR-32-5p的表达。与对照组相比,过表达miR-32-5p可抑制MDA-MB-231细胞的凋亡而促进细胞增殖和侵袭(P<0.05或P<0.01),敲低miR-32-5p则起相反的作用(均P<0.01)。结论:miR-32-5p/DKK3轴可能是影响乳腺癌发生发展的关键通路,过表达miR-32-5p能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡而促进细胞增殖和侵袭。

miR-32-5p靶向KLF4调控IL-6分泌影响食管癌细胞增殖和转移

目的研究miR-32-5p对食管癌Eca-109细胞增殖、迁移和侵袭的影响及潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测食管癌组织和细胞中KLF4和miR-32-5p RNA的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定Eca-109细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-32-5p与KLF4的调控关系,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子白细胞介素(IL)-6的表达,Western印迹检测KLF4和增殖凋亡蛋白的表达。结果食管癌组织中的miR-32-5p和IL-6表达量显著高于正常食管组织(P<0.05),KLF4表达量显著低于正常食管组织(P<0.05);抑制miR-32-5p表达和过表达KLF4均可抑制Eca-109细胞增殖、迁移和侵袭,抑制炎症因子IL-6的产生(均P<0.05);miR-32-5p靶向负调控KLF4的表达;抑制KLF4表达可逆转抑制miR-32-5p对Eca-109细胞增殖、迁移和侵袭及IL-6表达的抑制作用(均P<0.05)。结论miR-32-5p通过靶向KLF4抑制Eca-109细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制炎症因子IL-6的产生。miR-32-5p是抑制食管癌的潜在分子靶点。

miR-32-5p靶向CEBPA调控EGFR/β-catenin信号通路影响骨髓瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭

目的:探究miR-32-5p靶向CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinsα,CEBPA)调控表皮生长因子/β联蛋白(EGFR/β-catenin)信号通路影响骨髓瘤细胞增殖、凋亡和侵袭的机制。方法:qRT-PCR、Western blot检测细胞中miR-32-5p、CEBPA的表达水平;转染慢病毒至骨髓瘤细胞U266,MTT检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡水平;生物信息学预测miR-32-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因、Western blot验证miR-32-5p与CEBPA的关系及在骨髓瘤细胞中的作用,Western blot检测miR-32-5p与CEBPA的表达对EGFR/β-catenin信号通路的影响。结果:与正常浆细胞比较,骨髓瘤细胞株H929、U266、IM-9、RPMI-8226中miR-32-5p表达水平显著增高,CEBPA mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.05);与NC、anti-miR-con组比较,anti-miR-32-5p组miR-32-5p mRNA表达量显著降低,细胞凋亡率显著升高,24 h、48 h、72 h的OD值显著降低,细胞侵袭数目显著减少(P<0.05);TargetScan生物信息学预测显示,miR-32-5p与CEBPA 3'UTR存在结合位点,双荧光素酶报告实验、Western blot进一步证实miR-32-5p可与CEBPA直接结合负向调控CEBPA的表达;与NC、pcDNA-control组比较,pcDNA-CEBPA组CEBPA表达量显著升高,24 h、48 h、72 h的OD值显著降低,凋亡率显著升高,细胞侵袭数目显著减少(P<0.05);与anti-miR-con组比较,anti-miR-32-5p组CEBPA蛋白表达量显著升高,EGFR、p-EGFR、β-catenin蛋白表达量显著降低;与anti-miR-32-5p+si-con组比较,anti-miR-32-5p+si-CEBPA组CEBPA蛋白表达量显著降低,EGFR、p-EGFR、β-catenin蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论:骨髓瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭受miR-32-5p和CEBPA的双重调控,miR-32-5p可靶向CEBPA调控EGFR/β-catenin信号通路影响骨髓瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭。

miR-32-5p通过靶向下调EZH2的表达抑制胰腺癌PANC-1细胞的恶性生物学行为与裸鼠移植瘤生长

目的:探究miR-32-5p通过靶向zeste基因增强子人类同源物2(EZH2)对胰腺癌PANC-1细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制。方法:利用GEPIA数据库分析胰腺癌组织中EZH2的表达水平及其与患者的预后生存期的关系,并分析miR-32-5p表达与患者临床病理因素的关系。qPCR法检测正常胰腺HPDE6-C7细胞和胰腺癌PANC-1、AsPC-1、SW1990细胞中miR-32-5p和EZH2 mRNA的表达,通过Lipofectamine^(TM)2000将miR-NC、miR-32-5p mimic、miR-32-5p inhibitor、pcDNA-NC、pcDNA EZH2质粒分别转染PANC-1细胞,其分为对照组(不转染)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-32-5p mimic组(转染miR-32-5p mimic)、Anti-miR-32-5p组(转染miR-32-5p inhibitor)、miR-NC+pcDNA-NC组(转染miR-NC+pcDNA-NC)、miR-NC+pcDNA EZH2组(转染miR-NC+pcDNA EZH2)、miR-32-5p mimic+pcDNA-NC组(转染miR-32-5p mimic+pcDNA-NC)、miR-32-5p mimic+pcDNA EZH2组(转染miR-32-5p mimic+pcDNA EZH2)。双荧光素酶报告基因实验验证miR-32-5p与EZH2的靶向关系;MTT法及克隆形成实验检测各组细胞的增殖能力,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移能力;Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭能力,WB法检测各组细胞EZH2、E-cadherin、N-cadherin的表达;裸鼠成瘤实验检测转染后各组PANC-1细胞移植瘤的生长情况,免疫组化染色法观察移植瘤组织中Ki67和MMP-2的表达。结果:GEPIA数据库显示胰腺癌组织中EZH2的表达水平高于癌旁组织,患者预后生存期与EZH2的表达水平呈负相关(均P<0.05);miR-32-5p表达水平与胰腺癌神经浸润、肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有明显的关联(均P<0.05);与HPDE6-C7细胞相比,PANC-1、AsPC-1、SW1990细胞中miR-32-5p呈高表达、EZH2 mRNA呈低表达、miR-32-5p表达水平与EZH2表达水平呈负相关(均P<0.05)。miR-32-5p靶向EZH2且抑制其表达(均P<0.05);过表达miR-32-5p能够下调Ki67、MMP-2、N-cadherin表达水平、上调E-cadherin表达水平,抑制PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制移植瘤质量增加(均P<0.05)。结论:miR-32-5p能够靶向调控EZH2从而影响胰腺癌PANC-1细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT进程及裸鼠体内移植瘤的生长。

MiR-32-5p aggravates intestinal epithelial cell injury in pediatric enteritis induced by Helicobacter pylori

BACKGROUND Pediatric enteritis is one of the infectious diseases in the digestive system that causes a variety of digestive problems,including diarrhea,vomiting,and bellyache in children.Clinically,Helicobacter pylori(H.pylori)infection is one of the common factors to cause pediatric enteritis.It has been demonstrated that aberrant expression of microRNAs(miRNAs)is found in gastrointestinal diseases caused by H.pylori,and we discovered a significant increase of miR-32-5p in H.pylori-related pediatric enteritis.However,the exact role of miR-32-5p in it is still unknown.AIM To investigate the role of aberrant miR-32-5p in pediatric enteritis induced by H.pylori.METHODS MiR-32-5p expression was detected by quantitative real time-polymerase chain reaction.The biological role of miR-32-5p in H.pylori-treated intestinal epithelial cells was evaluated by Cell Counting Kit-8 assay and flow cytometry.The potential target of miR-32-5p was predicted with TargetScanHuman and verified by luciferase assay.The downstream mechanism of miR-32-5p was explored by using molecular biology methods.RESULTS We found that miR-32-5p was overexpressed in serum of H.pylori-induced pediatric enteritis.Further investigation revealed that H.pylori infection promoted the death of intestinal epithelial cells,and increased miR-32-5p expression.Moreover,miR-32-5p mimic further facilitated apoptosis and inflammatory cytokine secretion of intestinal epithelial cells.Further exploration revealed that SMAD family member 6(SMAD6)was the direct target of miR-32-5p,and SMAD6 overexpression partially rescued cell damage induced by H.pylori.The following experiments showed that miR-32-5p/SMAD6 participated in the apoptosis of intestinal epithelial cells induced by transforming growth factor-β-activated kinase 1(TAK1)-p38 activation under H.pylori infection.CONCLUSION Our work uncovered the crucial role of aberrant expression of miR-32-5p in H.pylori–related pediatric enteritis,and suggested that the TAK1-p38 pathway is involved in it.

miR-32-5p对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的研究miR-32-5p对胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡的作用及机制,以及与含硬化蛋白结构域蛋白1(sclerostin domain-containing protein 1,SOSTDC1)的关系。方法通过R语言分析筛出相比于正常胃组织,胃癌组织中有2倍以上表达差异的所有miRNA,同时预测差异2倍以上miRNA的靶基因,在其中确定研究目标miR-32-5p及SOSTDC1。采用qRT-PCR研究胃上皮细胞(GES-1)及胃癌细胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45)中miR-32-5p的表达水平。对MKN-45细胞进行转染,使其分为miR-NC mimics组(Lipofectamine 2000与miR-NC mimics共同转染)、miR-32-5p mimics组(Lipofectamine 2000与miR-32-5p mimics共同转染)、miR-NC inhibitor组(Lipofectamine 2000与miR-NC inhibitor共同转染)、miR-32-5p inhibitor组(Lipofectamine 2000与miR-32-5p inhibitor共同转染)。通过qRT-PCR检测过表达和敲除转染效率。通过集落克隆实验及CCK-8实验检测细胞增殖。采用流式细胞术检测细胞凋亡。通过Western blot实验检测miR-32-5p对凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3)、Wnt/β-catenin通路相关蛋白(β-catenin、p-GSK3β)的影响。利用基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)网站分析胃癌组织中SOSTDC1的表达情况。TargetScan则用于分析miR-32-5p与SOSTDC1之间的调控关系。通过Western blot实验检测miR-32-5p对SOSTDC1蛋白的影响。结果miR-32-5p在胃癌组织中高表达,与正常胃组织相比具有2倍以上表达差异(P<0.05),且miR-32-5p与SOSTDC1呈靶向关系。与胃上皮细胞GES-1相比,miR-32-5p在胃癌细胞系MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-45中显著高表达(P<0.05)。miR-32-5p mimics组细胞中miR-32-5p的表达相比于miR-NC mimics组增加(P<0.05);miR-32-5p inhibitor组细胞内miR-32-5p的表达水平则较miR-NC inhibitor组下降(P<0.05)。miR-32-5p mimics组细胞增殖能力与miR-NC mimics组相比增强(P<0.05);miR-32-5p inhibitor组细胞增殖能力则较miR-NC inhibitor组下降(P<0.05)。miR-32-5p mimics组细胞凋亡率较miR-NC mimics组下降(P<0.05);miR-32-5p inhibitor组细胞凋亡率则较miR-NC inhibitor组升高(P<0.05)。与miR-NC mimics组相比,miR-32-5p mimics组Bcl-2、β-catenin、p-GSK3β的蛋白表达水平升高,而Bax、cleaved-Caspase-3的蛋白水平下降(P<0.05);与miR-NC inhibitor组相比,miR-32-5p inhibitor组Bcl-2、β-catenin、p-GSK3β的蛋白表达下降,而Bax、cleaved-Caspase-3的蛋白表达上升(P<0.05)。与正常胃组织相比,SOSTDC1在胃癌组织中低表达(P<0.05)。miR-32-5p与其下游靶基因SOSTDC1相互结合。与miR-NC mimics组相比,miR-32-5p mimics组SOSTDC1的表达下降(P<0.05);而与miR-NC inhibitor组相比,miR-32-5p inhibitor组SOSTDC1表达增加(P<0.05)。结论miR-32-5p在胃癌细胞中通过抑制SOSTDC1的表达介导Wnt/β-catenin通路的激活而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。

下调miR-32-5p表达对顺铂耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制

目的探讨下调微小RNA-32-5p(miR-32-5p)表达对顺铂(DDP)耐药肺癌细胞化疗敏感性的影响及其机制。方法体外培养人肺癌细胞系A549、SPC-A-1、H226(以下分别称A549、SPC-A-1、H226细胞)和人正常肺支气管上皮细胞系BEAS2B(以下称BEAS2B细胞),采用RT-qPCR法检测miR-32-5p表达,选择miR-32-5p相对表达量最高的肺癌细胞进行后续实验。采用药物持续接触、浓度递增诱导法筛选DDP耐药肺癌细胞。采用MTS法检测肺癌细胞及其DDP耐药细胞DDP半数抑制浓度(IC50),采用RT-qPCR法检测肺癌细胞及其DDP耐药细胞miR-32-5p表达。选择上述DDP耐药肺癌细胞,随机分为观察组和对照组,分别转染miR-32-5p inhibitor、NC inhibitor,采用RT-qPCR法验证转染效率,采用MTS法检测两组DDP IC50,采用流式细胞仪检测两组细胞凋亡率,采用Western blotting法检测两组Bax、Bcl-2蛋白表达。通过TargetScan7.2软件预测miR-32-5p的靶基因。取DDP耐药肺癌细胞,随机分为miR-32-5p mimic-TCF21-wt组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组、miR-32-5p mimic-TCF21-mut组、miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组,相应转染miR-32-5p mimic或miR-32-5p inhibitor、pGLO-TCF21-wt或pGLO-TCF21-mut,采用双荧光素酶报告基因实验检测各组荧光素酶活性。结果A549、SPC-A-1、H226细胞miR-32-5p相对表达量均高于BEAS2B细胞,且A549细胞miR-32-5p相对表达量高于SPC-A-1、H226细胞(P均<0.05)。故选择A549细胞进行后续实验。A549细胞与DDP耐药A549细胞的DDP IC 50分别为(2.92±0.18)、(15.47±3.01)μg/mL,miR-32-5p相对表达量分别为1.00±0.03、12.35±2.87,二者比较P均<0.05。观察组与对照组miR-32-5p相对表达量分别为0.27±0.08、1.00±0.05,DDP IC50分别为(7.43±1.25)、(16.22±2.54)μg/mL,细胞凋亡率分别为(7.69±0.24)%、(2.35±0.18)%,两组比较P均<0.05。观察组Bax蛋白相对表达量高于对照组,Bcl-2蛋白相对表达量低于对照组(t分别为5.28、9.54,P均<0.05)。TargetScan7.2软件在线预测显示,TCF21启动子区与miR-32-5p具有结合位点。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-32-5p mimic-TCF21-wt组荧光素酶活性低于miR-32-5p inhibitor-TCF21-wt组(P<0.05),而miR-32-5p mimic-TCF21-mut组与miR-32-5p inhibitor-TCF21-mut组荧光素酶活性比较P>0.05。结论下调miR-32-5p表达能够提高DDP耐药肺癌细胞化疗敏感性,其机制与靶向调控TCF21能够促进Bax蛋白表达、抑制Bcl-2蛋白表达,从而提高细胞凋亡率有关。

miR-32-5p靶向FOXN3调控EMT通路影响子宫内膜癌细胞迁移和侵袭

目的研究miR-32-5p对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭的影响和潜在机制。方法以人正常子宫内膜上皮细胞h EEC为对照,qRT-PCR和Western blot检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1A和JEC中miR-32-5p和FOXN3的表达;在Ishikawa细胞中高表达FOXN3和敲减miR-32-5p,Western blot检测FOXN3、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-32-5p和FOXN3的关系。结果与hEEC相比,子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1A和JEC组细胞中miR-32-5p表达量均显著升高(P<0.05),FOXN3的mRNA和蛋白表达量均显著下降(P<0.05);采用表达差异较大的Ishikawa进行后续实验。抑制miR-32-5p表达后Ishikawa细胞迁移数量、和侵袭数量以及N-Cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低(P<0.05),E-Cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。高表达FOXN3后Ishikawa细胞迁移数量和侵袭数量以及N-Cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低(P<0.05),E-Cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。miR-32-5p靶向负向调控FOXN3的表达。敲减FOXN3部分逆转了抑制miR-32-5p表达对Ishikawa细胞迁移、侵袭以及E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。结论 miR-32-5p靶向FOXN3可能通过EMT通路调控子宫内膜癌细胞迁移和侵袭。miR-32-5p是子宫内膜癌的潜在分子靶点。

miRNA-32-5p对EZH2基因的靶向调控以及对口腔癌细胞CAL-27增殖的影响

目的:构建miR-32-5p慢病毒载体,研究其对EZH2基因的靶向调控作用以及对CAL-27细胞增殖作用的影响。方法:分别构建p Sico R-miR-32-5p及p MIR-Report-EZH2过表达载体,应用双荧光素酶报告基因系统、Western免疫印迹及实时定量荧光PCR方法验证miR-32-5p与EZH2的靶向调控关系,应用MTT法检测过表达miR-32-5p后对CAL-27细胞的增殖调节作用,采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:成功构建了p Sico R-miR-32-5p及p MIR-Report-EZH2重组质粒,并证实miR-32-5p过表达可明显抑制EZH2的蛋白及m RNA的表达水平(P<0.05);抑制miR-32-5p的表达,则明显上调EZH2的蛋白及m RNA的表达水平(P<0.05);MTT结果显示,miR-32-5p可显著抑制CAL-27的增殖。结论 :miR-32-5p可通过靶向作用于EZH2-3’UTR的特异序列,直接抑制EZH2基因的表达并调控CAL-27细胞的增殖。

微小RNA-32-5p对老年急性心肌梗死有诊断价值

目的:探究微小RNA-32-5p(miR-32-5p)对老年急性心肌梗死(AMI)的诊断价值。方法:纳入老年AMI患者107例为AMI组,选取同期收治的老年稳定性冠心病(SCHD)患者98例为SCHD组,选取同期体检的健康志愿者82例为对照组,检测并比较分析3组血清miR-32-5p表达及肌钙蛋白I(TnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、白介素(IL)-1β、IL-6、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。采用超声心动图检测3组左心室收缩末内径(LVESD)、左心室舒张末内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)。对AMI组患者根据Gensini评分进行分组,分为<50分组和≥50分组,比较2组AMI患者的上述各指标,利用Pearson线性相关分析miR-32-5p与TnI、CK-MB、NT-proBNP、IL-1β、IL-6、TNF-α、hs-CRP、LVESD、LVEDD、LVEF的相关性,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析miR-32-5p诊断老年AMI的曲线下面积(AUC)。结果:AMI组血清miR-32-5p表达及TnI、CK-MB、NT-proBNP、LVESD、LVEDD、IL-1β、IL-6、TNF-α、hs-CRP水平高于SCHD组和对照组,且SCHD组高于对照组;LVEF低于SCHD组和对照组(P均<0.05)。Gensini评分≥50分组血清miR-32-5p及TnI、CK-MB、NT-proBNP、LVESD、LVEDD、IL-1β、IL-6、TNF-α、hs-CRP水平高于Gensini评分<50分组,LVEF低于Gensini评分<50分组(P均<0.05)。Pearson线性相关分析显示血清miR-32-5p表达与TnI、CK-MB、NT-proBNP、LVESD、LVEDD、IL-1β、IL-6、TNF-α、hs-CRP水平呈正相关,与LVEF呈负相关(P均<0.05)。血清miR-32-5p诊断AMI的AUC为0.788(P=0.000,95CI%:0.721~0.855)。结论:老年AMI患者的血清miR-32-5p表达上调,对AMI的诊断有一定价值。