Pellet法和Micromass法诱导软骨终板干细胞成软骨的比较

[目的]比较Pellet法和Micromass法诱导软骨终板干细胞成软骨的能力。[方法]临床获取腰椎退变椎间盘软骨终板,采用琼脂糖筛选软骨终板干细胞后进行传代扩增,扩增后的软骨终板干细胞分别行Pellet和Micromass法进行成软骨诱导1～3周。分别于1～3周对诱导的软骨组织进行湿重和阿利新蓝密度比较,同时对诱导3周的软骨组织进行特殊染色,Ⅰ、AGG、Ⅱ型胶原免疫化学染色以及定量PCR检测软骨相关基因的比较。[结果]使用Mi-cromass法诱导软骨终板干细胞所形成的软骨组织在相应时间比Pellet法重量大(P<0.05)。阿利新蓝密度比较亦提示相应时间点Micromass法所诱导的软骨组织比Pellet法高(P<0.05)。特殊染色结果分析表明采用Micromass法所形成的软骨基质较多且均质;免疫组织化学法表明Micromass法所表达的Ⅱ型胶原、AGG较Pellet法多,而Ⅰ胶原则相反。实时定量PCR结果亦提示采用Micromass法诱导所形成的软骨组织中Ⅱ型胶原、AGG基因表达高(P<0.05),而Sox 9无明显区别(P>0.05)。[结论]采用Micromass法诱导软骨终板干细胞所形成的软骨基质更加丰富和均质,因此,Micromass法更适合对软骨终板干细胞进行成软骨相关机制及信号传导的研究。

三种大鼠椎间盘细胞提取、鉴定及在单层和微团培养中的基质表达

背景:目前获得椎间盘原代细胞的方法大多较繁琐,且缺少同时提取纤维环、终板与髓核原代细胞的相关报道,因此找到同时提取3种细胞的方法十分关键。目的:探索一种同时提取并培养大鼠来源3种椎间盘细胞(纤维环、终板与髓核)的方法,对之进行鉴定并探究单层与微团培养对细胞外基质的影响。方法:取材自3周龄雄性SD大鼠椎间盘组织,从其中分离出软骨终板、髓核与纤维环组织。针对髓核及纤维环组织,先使用0.1%链酶蛋白酶E于37℃消化30 min,然后使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞;针对终板组织,直接使用0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h来释放其中的细胞。将去除消化酶后的细胞接种于含有培养基的培养皿中,并观察细胞形态;通过实时定量荧光PCR与蛋白印迹实验检测各细胞标记物的表达水平;单层或微团培养大鼠原代纤维环细胞与软骨终板细胞,并采用阿尔新蓝与番红染色检测细胞外基质的表达能力。结果与结论:①3种椎间盘细胞均在培养4 d后开始贴附在皿底,并逐渐展现出增殖的活力;培养至第8天时,3种细胞增殖显著,形态均呈梭形,其中髓核细胞中存在多囊泡的脊索样细胞;②通过实时定量荧光PCR和/或蛋白免疫印迹实验发现原代髓核细胞中K19与Car3表达较高,原代纤维环细胞中Sparc与Bgn表达较高,原代软骨终板细胞中Pth1r与Lars2表达较高;③原代纤维环、软骨终板细胞微团培养后,经阿尔新蓝与番红染色证明这种培养方式相较于单层培养能够提高细胞外基质的表达能力;④结果表明,通过此次实验方法提取并培养获得的原代椎间盘细胞形态较好并具有较高的胞外基质表达水平,这一成果有望为科研人员提供一种新的科研工具,帮助科研人员更好地理解椎间盘生物学。

Effects of V2O5 on Proliferation and Differentiation of Limb Bud Cells of Rat

The micromass culture was used to determine the effects of vanadium pentoxide (V2O5 ) on the proliferation and differentiation of limb bud cells of rat. In the in vitro test, the results showed that V2O5 had obvious inhibiting effects on both proliferation and differentiation of limb bud cells with a dosedependent response, its proliferating and differentiating IC50 being 13.64 and 4.77μmol/L, respectively. In the in vivo/in vitro test, the results showed that V2O5 had no obvious effect on cell proliferation but had obvious inhibiting effect on cell differentiation. These results indicated that V2O5 might have a specific inhibiting effect on the differentiation of limb bud cells.

鹿茸再生干细胞成骨诱导(微粒体)培养体系的建立

针对鹿茸再生活体研究周期长、耗资大、对动物损伤大等问题,利用在培养液中加入TGF-β1、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油等对鹿茸再生干细胞进行体外诱导,成功建立了一种鹿茸再生干细胞体外诱导成骨的培养体系,模拟了鹿茸软骨内骨化的生长过程。

一种新的适合于农杆菌介导的非洲菊基因转化受体体系

农杆菌介导的基因转化成功与否及效率与所选择的外植体类型有密切关系。报告以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为起始材料,将其匀浆分散成小细胞团,并用该小细胞团为外植体进行农杆菌介导的基因转化,经GUS组织化学染色和抗生素筛选培养证明,用此体系可高效率地获得非洲菊转基因愈伤,该愈伤可能进一步再分化出转基因植株。

超声引导下空芯针穿刺与微创旋切取芯活检系统对乳腺微小肿物病理组织学诊断价值

目的研究超声引导下空芯针穿刺与微创旋切取芯活检系统对乳腺微小肿物病理组织学的诊断价值。方法将200例女性乳腺微小肿物患者采用随机数字表法分为旋切取芯活检组和空心针穿刺活检组,每组100例,分别采用微创旋切取芯活检、空芯针穿刺系统活检,将2种方法取得的病理标本置入甲醛固定溶液,常规脱水、包埋、切片,HE染色,显微镜下观察病理结果,以切除活检(EB)的病理为金标准,比较2种活检方式取得的病理与术后病理的符合率,诊断特异性,诊断敏感性,分析2种诊断的假阴性率,比较两种活检并发症发生情况。结果2种方法取材成功率100%,旋切取芯活检组准确率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度均高于空芯针穿刺活检组(P<0.05),假阴性率低于空芯针穿刺活检组(P<0.05)。2组患者的主要不良反应为疼痛,发生率分别为8%,5%,旋切取芯活检组低于空芯针穿刺活检组,但差异无统计学意义(P>0.05),旋切取芯活检组不良反应总发生率低于旋切取芯活检组差异有统计学意义(P<0.05)。结论CassiⅡ微创旋切取芯活检系统通过导引针精准定位病灶-低温冷冻固定目标-自动旋切切取组织对获得的乳腺微小肿物样本具有较高的病理符合率、诊断特异性及敏感性,且疼痛反应轻,出血、淤血、皮下渗血等不良反应少,早期乳腺癌患者将得到很大获益。

金属致畸的体外系统研究

用大鼠胚胎神经细胞微团培养法，研究了镉、铬、铝、铅、镍、钡、锆、钯八种金属化合物的体外致畸作用，并提出了金属化合物的体外细胞致畸结果判断标准。结果表明，八种金属化合物都有较明显的细胞毒性，都能抑制胚胎神经细胞分化。镉、铬、铝、铅、镍五种化合物对神经细胞的半数分化抑制浓度（ＩＣｄ５０）均小于１μｇ／ｍｌ，半数存活抑制浓度（ＩＣｖ５０）与ＩＣｄ５０比值（Ｖ／Ｄ）均大于６．０，判断为体外细胞致畸试验阳性。钡、锆、钯三种金属化合物Ｖ／Ｄ值近于１，认为其对细胞分化的抑制作用是由细胞毒性所致。

五氧化二钒对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响

本研究采用微团培养观察了Ｖ２Ｏ５对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响，旨在为进一步揭示其发育毒作用机理提供依据。结果显示，Ｖ２Ｏ５对体外中脑细胞的增殖和分化均有抑制作用，并有明显的剂量－反应关系。Ｖ２Ｏ５抑制中脑增殖和分化的ＩＣ５０分别为９１和６８μｍｏｌ／ｌ。体内／体外结合试验显示，Ｖ２Ｏ５在２０ｍｇ／ｋｇ时对细胞分化有明显的抑制作用，而在５０ｍｇ／ｋｇ时才对细胞增殖出现抑制作用，按照Ｒｅｎａｕｌｔ的分类标准。

稳恒磁场对体外胚胎中脑神经元细胞分化影响的研究

本文利用大鼠胚胎中脑神经细胞作原代微团培养，培养物经不同强度（分别为５ ｍ Ｔ，１０ ｍ Ｔ，２０ｍ Ｔ，３０ ｍ Ｔ，４０ ｍ Ｔ，５０ ｍ Ｔ和６０ ｍ Ｔ）的稳恒磁场作用，研究其对细胞生长和分化的影响，并利用图像分析细胞形态的变化。结果表明：各种强度的稳恒磁场能明显地抑制中脑神经细胞的分化，集落形成率明显减少，且细胞表面的突起和集落间的神经纤维束减少。

同型半胱氨酸对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响

为深入揭示同型半胱氨酸(hom ocysteine,HCY)的致畸性及作用机理,应用大鼠胚胎中脑细胞微团培养法探讨了HCY(0～10m m ol/L)对胚胎中脑细胞增殖和分化的影响。结果显示:随着剂量的增加,HCY对胚胎中脑细胞分化具有促进和抑制双相作用,半数抑制分化浓度(IC50 )为4.3m m ol/L,当加入肝微粒体S9时,IC50减至2.3m m ol/L;在实验剂量范围内,HCY对中脑细胞增殖无明显抑制作用。上述结果说明HCY 对大鼠胚胎中脑细胞分化的影响明显高于对细胞增殖的影响。

苯对小鼠胚胎肢芽和中脑细胞分化与增殖的影响

目的探讨苯对胚胎肢芽、中脑细胞分化和增殖的影响及对肢芽器官发育的影响。方法分离12d龄小鼠胚胎肢芽和中脑细胞进行微团培养,观察肢芽和中脑细胞的分化与增殖;结果随着苯染毒浓度的增加,胚胎肢芽细胞分化为软骨细胞的集落数逐渐减少,中脑细胞形成神经集落数减少、体积小,集落细胞间突起数量减少,肢芽细胞和中脑细胞增殖率下降,均具有较明显的剂量-效应关系;苯对肢芽细胞的半数分化抑制浓度(dID50)和半数增殖抑制浓度(pID50)分别为89.93μmol/L和396.77μmol/L,对中脑细胞的dID50和pID50分别为116.29μmol/L和831.46μmol/L,对细胞分化的抑制作用大于对增殖的抑制作用。结论苯对胚胎中脑及肢芽细胞的分化和增殖有特异性抑制作用,可能对胚胎骨和脑具有发育毒性。

砷对大鼠肢芽细胞增殖和分化的影响

为了进一步阐明三氧化二砷的发育毒性，本研究应用Ｆｌｉｎｔ等人建立的胚胎肢芽细胞微团培养法，探讨了不同浓度砷对体外培养的ＳＤ大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响。结果表明砷对大鼠肢芽细胞的增殖和分化均有抑制作用，呈明显的剂量－反应关系；砷对肢芽细胞的５０％增殖抑制浓度（ＩＰ５０）和５０％分化抑制浓度（ＩＤ５０）分别为０．７０ｍｇ／Ｌ和０．２１ｍｇ／Ｌ；ＩＰ５０／ＩＤ５０值为３．３，揭示砷对大鼠肢芽细胞分化的影响要远大于对细胞增殖的影响。根据Ｒｅｎａｕｌｔ等人推荐的体外致畸判断标准，砷属于强致畸物。实验结果提示砷对大鼠肢芽细胞分化的抑制作用可能并非其细胞毒性作用所致，这是砷致畸作用的重要基础之一。此外还初步探讨了大鼠肢芽细胞异常分化的分子机制。

生长分化因子5促进脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的研究生长分化因子(GDF5)在诱导脂肪干细胞(ADSCs)成软骨分化中的作用。方法大鼠ADSCs在不同诱导条件下经细胞微团培养后,通过检测细胞增殖、糖胺聚糖和蛋白聚糖、软骨细胞特异性基因CollagenⅡ、AggrecanmRNA和蛋白质表达,以及软骨细胞肥大标志基因CollagenⅠ、CollagenⅩ的表达水平,比较不同浓度的GDF5(10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml)与TGFβ1(10ng/ml)对ADSCs成软骨分化的促进作用。结果 GDF5对AD-SCs成软骨分化过程中的细胞增殖具有显著的促进作用,同时还能增加细胞外基质糖胺聚糖和蛋白聚糖的含量,以及上调软骨细胞特异性CollagenⅡ和Aggrecan基因和蛋白表达。在10ng/ml、100ng/ml和1000ng/ml的GDF5剂量组中以100ng/ml为最佳浓度,其效果显著优于10ng/ml的TGFβ1。结论本研究结果表明GDF5能够显著促进脂肪干细胞的成软骨分化,并且以100ng/ml的效果最为明显。

采用微团培养技术探讨双酚A的体外发育毒性

采用微团培养观察了不同浓度的双酚A(0～ 5 0mg L)对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响 ,旨在了解双酚A的体外发育毒性特点及其可能的作用机制。结果显示 :双酚A对体外培养的Wistar大鼠胚胎肢芽细胞的增殖和分化均有抑制作用 ,表现为染毒组肢芽细胞集落形成数量减少 ,细胞毒性试验吸光度值下降 ,并呈现出明显的剂量 反应关系。双酚A对肢芽细胞的 5 0 %增殖抑制浓度 (IP50 )和5 0 %分化抑制浓度 (ID50 )分别为 38 74mg L和 2 7 93mg L ,IP50 ID50 =1 39。按照Renault等人推荐的体外致畸分类标准 ,双酚A属于阳性致畸物 。

羟基脲对大鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响

背景与目的:为探讨羟基脲(HU)对胚胎发育的作用,采用胚胎中脑细胞微团培养研究HU对细胞增殖和分化的影响。材料与方法:从13d龄的鼠胚胎中分离中脑细胞,加入不同浓度的HU体外连续培养5d,观察细胞分化和细胞增殖情况。结果:对照组原单个分散的细胞形成明显的细胞集落,集落间有丰富的神经纤维,并连结成网状,而不同HU剂量组细胞集落数目减少,集落间的神经纤维束减少,并呈现出剂量-效应关系,显示HU可明显抑制中脑细胞的增殖和分化,阻止神经形成和集落形成过程,HU半数细胞增殖抑制浓度(IcV50)为0.078mmol/L(5.9μg/ml),半数细胞分化抑制浓度(IcD50)为0.018mmol/L(1.37μg/ml),其IcV50与IcD50比值为4.33。结论:HU是一种非特异性细胞增殖和分化抑制剂,具有体外细胞致畸作用。

补肾活血方含药血清对小鼠肢芽细胞增殖和分化的影响

目的探讨补肾活血方对小鼠肢芽细胞向软骨细胞分化增殖的影响。方法分离12.5天小鼠胚胎肢芽细胞进行微团培养,同时用补肾活血方含药血清进行干预。采用MTT法检测肢芽细胞的增殖活性,阿尔新蓝染色检测肢芽细胞分化为软骨细胞能力,RT-PCR法检测肢芽细胞中Col2a1、Col10a1、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA的表达水平。结果与空白对照组比较,补肾活血方含药血清组在24 h、48 h和72 h 3个时间点均能显著促进小鼠肢芽细胞增殖。微团培养6 d后,阿尔新蓝染色结果显示补肾活血方含药血清组软骨细胞集落形成增加。RT-PCR结果显示补肾活血方含药血清组肢芽细胞Col2a1 mRNA表达水平增加,而Col10a1、Mmp9、β-catenin、Runx2 mRNA表达下调。结论补肾活血方含药血清可能通过β-catenin信号通路促进小鼠胚胎肢芽细胞的增殖与分化。

无机氟对大小鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响

选用SD大鼠,昆明种小鼠,采用胚胎中脑细胞微团培养方法,观察无机氟对胚胎中脑细胞增殖和分化的影响。结果显示培养液中一定浓度的氟对两种动物胚胎中脑细胞增殖和分化有明显抑制作用,呈剂量—反应关系。拟合细胞分化和增殖抑制曲线,计算大、小鼠半数抑制分化浓度(ID_(50))分别为7.1μg/ml、8.5μg/ml;半数抑制增殖浓度(IP_(50))为40.3μg/ml、51.5μg/ml IP_(50)/ID_(50)比值分别为5.68和6.06。表明无机氟是中脑细胞分化的特异性抑制剂,可能是潜在的致畸性。并表现有一定的种属差异.

羟基脲对大鼠胚胎的肢芽和中脑细胞增殖和分化的影响

目的观察羟基脲(抗肿瘤药)对大鼠胚胎细胞增殖和分化的影响。方法用大鼠胚胎的中脑和肢芽细胞,用微团培养法观察不同浓度的羟基脲对其增殖和分化的影响。结果羟基脲对中脑细胞和肢芽细胞的半数增殖抑制浓度(IV50)分别为5.90、2.48μg·mL-1,半数分化抑制浓度(ID50)分别为2.01、0.67μg·mL-1。羟基脲对胚胎中脑和肢芽细胞增殖和分化具有明显的抑制作用,且呈剂量-反应关系。结论羟基脲对发育期神经母细胞和肢芽细胞的增殖和分化均具有抑制作用,可能是羟基脲导致中枢神经系统和四肢畸形的作用机制之一。

高密度微团培养法对人骨关节炎软骨细胞分化影响的实验研究

目的探讨高密度微团(Micromass)的细胞培养方法对人骨关节炎软骨细胞终末期成熟分化的作用影响。方法临床获取人骨关节炎关节软骨组织,分离骨关节炎软骨细胞,分别进行低密度单层培养和高密度微团培养,隔日细胞换液1次。每2日倒置显微镜观察细胞形态的变化;碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测ALP的分泌;RT-PCT方法检测细胞内Col2、Aggrecan、ALP和MMP-13等因子mRNA的表达。结果人骨关节炎软骨细胞具有自发性向终末期成熟分化的特征,在相同时间点,Micromass培养的软骨细胞与低密度单层培养的细胞相比,更具有软骨细胞的形态特征;ALP染色显示,Micromass培养的细胞内ALP染色强度明显减弱;RT-PCT显示,Micromass培养的细胞内Col2和Aggrecan因子mRNA的表达显著提高(P<0.05);ALP和MMP-13因子mRNA的表达显著降低(P<0.05)。结论高密度微团培养法抑制人骨关节炎软骨细胞过快的成熟分化,更好的维持了细胞的软骨细胞表型。

酒精对小鼠神经母细胞发育的影响

目的 探讨酒精对胚胎神经母细胞发育的影响及其与畸形发生之间的联系。 方法 从 12 d龄、体节数 34～ 36的小鼠胚胎分离中脑神经母细胞接种培养板 ,给予不同剂量的酒精于体外连续培养 5 d后 ,检测酒精对细胞增殖和分化的影响 ,及其线粒体膜电位的变化和细胞凋亡情况。 结果 酒精对中脑神经母细胞增殖和分化均有抑制作用 ,其分化抑制剂量 ( ID50 )和增殖抑制剂量( IP50 )分别为 2 10 .2 9m M和 336 .5 5 m M,分化比增殖更敏感。随酒精染毒剂量的增加 ,细胞线粒体膜电位呈下降趋势 ,凋亡和坏死细胞数量逐渐增加 ,存在剂量 -反应关系。