不同山茶种质组培条件下染色体倍性的维持与变化

植物染色体的倍性维持和变化受环境因素影响,组培再生过程由于培养条件等因素往往导致染色体的结构和倍性变化。为探索组培条件下山茶种质的倍性变化,该研究利用山茶种质的愈伤组织诱导体系,通过流式细胞仪分析倍性变化情况,并结合秋水仙素处理对组培再生条件下倍性的稳定性和变化进行分析。结果表明:(1)10个山茶种质中6个为二倍体,2个为四倍体,1个为六倍体和1个为十倍体,在组培诱导愈伤及再生过程中不同倍性的种质材料能够保持稳定的倍性。(2)获得了秋水仙素处理的最适诱导条件,即培养基配方为秋水仙素浓度20 mg·L^(-1),愈伤增殖培养10 d。(3)对56个独立组织样品(含愈伤和芽)开展了倍性检测发现,有38个组织样品的倍性在1.5~2.5倍之间,11个组织样品产生了低于1.5倍性的特异现象。该研究结果进一步探索了不同山茶种质之间的倍性关系,为山茶属植物的倍性调控和多倍体诱导提供了理论基础。

CD71荧光抗体和PI染色的微核流式细胞术检测研究

目的探索CD71荧光抗体和PI染色的微核流式细胞术自动化检测方法。方法采用-85℃甲醇固定细胞,CD71荧光抗体和PI染色,以伯氏疟原虫感染小鼠血细胞为微核模式生物调校流式细胞仪,建立微核流式细胞术检测方法,并对秋水仙素(COL)诱导的小鼠外周血含微核网织红细胞进行了检测。结果所建立的方法能明确分辨外周血含与不含微核的网织红细胞和成熟红细胞,COL处理小鼠的外周血含微核网织红细胞率呈明显的剂量依赖性升高,流式细胞术与显微镜检测的外周血含微核网织红细胞率有良好相关性(r=098)。结论微核流式细胞术检测方法能准确地检测小鼠外周血含微核网织红细胞。

四倍体不结球白菜的诱导及染色体倍性鉴定

用不同浓度秋水仙素处理子叶期不结球白菜生长点对其进行染色体倍性操作,根据形态解剖学、细胞学特征和流式细胞仪进行倍性鉴定.结果表明,浓度为0.2%的秋水仙素处理4次的效果最好,四倍体诱变率为8.42%.与二倍体相比,四倍体植株叶片、花器官、气孔等均表现巨大性;气孔密度和结实率降低;抽薹较晚.用流式细胞仪进行倍性鉴定,对照DNA相对含量为100,疑似株为200,表明是四倍体;疑似株有2个值与对照的比值约为1和2,表明是嵌合体(2x+4x).流式细胞仪鉴定结果与染色体计数法鉴定结果一致,表明流式细胞仪可以较准确地检测不结球白菜突变株倍性.

木薯成熟种茎多倍体诱导及鉴定

以木薯品种SC205和新选048的成熟种茎为材料,利用秋水仙素对侧芽进行滴液法处理诱导多倍体,使用流式细胞仪鉴定木薯植株倍性,并通过形态学、解剖学、生理学方法鉴定和分析多倍体、嵌合体和二倍体特征特性。结果表明:通过诱变处理获得了木薯四倍体和嵌合体植株,四倍体和嵌合体植株与二倍体相比表现出最上部全展叶第1和第2叶叶形指数降低、叶片厚度增加,气孔密度变小,叶绿体数目增加,气孔长度、保卫细胞长度和宽度增大,叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、叶绿素总量、SPAD值增高,净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率增大。

澳洲坚果多倍体的化学诱导及流式细胞术鉴定

以澳洲坚果品种‘云澳57’、‘云澳51’、‘云澳41’和‘云澳58’的萌动种子和幼嫩顶芽为材料,采用浓度为0.1％～0.3％的秋水仙素分别处理48、72（种子）或96 h（顶芽）,对种子的发芽率、幼苗形态和顶芽存活率等进行观测,并对有形态性状变异的植株进行流式细胞术倍性检测.结果表明：随着秋水仙素浓度和浸泡时间的增加,种子的发芽速率减慢,发芽率呈现显著的降低趋势,且不同品种对秋水仙素浓度的敏感性有所差异;大多数处理后种子萌发的幼苗出现了植株矮化、生长缓慢、第一对真叶显著变小或畸形甚至缺失、茎干明显增粗、叶尖出现分叉或卷曲、根系变为须根系等性状,部分幼苗叶片显著增大或分枝显著增多.不同浓度的秋水仙素溶液均可导致澳洲坚果嫁接苗顶芽存活率的降低,但大多顶芽并未出现形态变化.流式细胞术检测发现,在处理后种子萌发的幼苗中出现了多倍体,但均为2C＋4C或2C＋4C＋8C的嵌合体,且多倍体诱变率在5％以下;经秋水仙素处理的嫁接苗顶芽并未检测到倍性变化.

秋水仙素诱导百合多倍体及流式细胞仪倍性鉴定研究

采用组织培养的方法研究了秋水仙素处理对百合胚性愈伤组织再生和染色体加倍的效应,并优化了采用流式细胞仪进行百合倍性鉴定的技术。结果表明:不同秋水仙素浓度和处理时间对百合胚性愈伤组织进行诱导获得的诱导加倍率不同,采用0.5 mg∕L的秋水仙素处理百合胚性愈伤组织24 h诱导加倍率最高,为12.14%;加倍后的四倍体气孔保卫细胞明显变大,四倍体比二倍体植株变矮,叶片颜色加深并肉质化加厚。优化了采用流式细胞仪对百合进行倍性检测的条件,发现以组培苗新叶为材料,采用Kiwifruit buffer解离液解离、400目滤膜过滤,并进行1次离心是流式细胞仪鉴定百合倍性的适宜条件,并用优化后的方法鉴定了四倍体植株。

美洲黑杨×小叶杨杂种多倍体诱导研究

用不同浓度秋水仙素处理美洲黑杨(Populus deltoides)与小叶杨(Populus simonii)杂种后代以诱导产生多倍体,并采用流式细胞术(FCM)对初选的多倍体材料进行DNA含量分析。结果表明:小于0.1%秋水仙素浓度处理对诱导多倍体无作用;0.3%及其以上浓度处理对诱导产生多倍体效果较好,但随处理浓度增加秋水仙素对杨树的毒害作用增大,0.5%浓度处理可使顶芽死亡率高达71.43%,且在顶芽死亡的植株中未发现多倍体单株。应用气孔性状对388株扦插苗进行多倍体初选后,采用流式细胞术对初选的5株拟多倍体进行DNA含量分析,鉴定到2株四倍体材料。获得的四倍体材料与二倍体植株在株高和叶绿素含量上差异显著,但在SOD和POD活性上无显著性差异。

氯化镍染毒对小鼠外周血网织红细胞微核形成的影响

目的研究氯化镍(NiCl2)诱导小鼠外周血网织红细胞微核形成的作用。方法将30只健康的成年雄性NIH小鼠随机分为6组,设生理盐水对照组、秋水仙素阳性对照组(剂量为0.75mg/kg)、环磷酰胺阳性对照组(剂量为40.0mg/kg)和NiCl2染毒组(剂量分别为5.0、10.0、20.0mg/kg),分2次腹腔注射染毒,间隔24h,每次按0.1ml/10g体重腹腔注射。采用转铁蛋白受体荧光抗体和碘化丙碇染色,以疟原虫感染小鼠外周血红细胞为微核生物模型,调校流式细胞仪,检测秋水仙素、环磷酰胺和0、5.0、10.0、20.0mg/kgNiCl2染毒后小鼠外周血含微核网织红细胞率的变化。结果秋水仙素和环磷酰胺染毒小鼠的外周血含微核网织红细胞率均明显高于对照组小鼠(P<0.01),但不同剂量NiCl2染毒小鼠外周血含微核网织红细胞率均未见明显升高(P>0.05)。结论该研究条件下未观察到氯化镍有明显的诱导小鼠外周血网织红细胞微核形成的作用。

野生长穗桑种质资源云7的多倍体诱导和鉴定

以野生长穗桑(Morus wittiorum Hand-Mazz)多倍体(2n=7x=49)种质资源云7组培苗的不定芽为材料,用不同浓度秋水仙碱处理一定时间后进行组织培养,观察、鉴定萌发多倍体植株的染色体加倍的效果。不定芽经2 g/L秋水仙碱溶液(以二甲基亚砜作为渗透剂)浸泡2.5 d后,其死亡率为53.76%。以此接近半致死率的诱导条件诱导供试桑树不定芽的染色体加倍,并对其组培苗的腋芽持续多代分离筛选,经过染色体计数观察与流式细胞技术鉴定其倍性,最终得到2株稳定的十四倍体(2n=14x=98)长穂桑植株。诱变植株移栽至室外环境后生长状态良好,由此实现了对野生长穂桑种质资源染色体的人工加倍。

不同刺激剂PHA和ConA对绒山羊淋巴细胞有丝分裂中期化的影响

试验旨在探索使较高比例的淋巴细胞富集在有丝分裂G2/M期的最佳条件。运用植物血凝素(PHA)和刀豆蛋白A(ConA)对淋巴细胞进行刺激使其增殖,培养一定时间后加秋水仙素对淋巴细胞进行同步化处理,用流式细胞仪检测G2/M期的细胞数量进行比对,观察试剂的最佳作用浓度和加秋水仙素的最佳时间。结果表明,采用PHA和ConA刺激淋巴细胞增殖的最佳作用浓度是60和5μg/mL,且淋巴细胞经ConA刺激培养45h再加秋水仙素处理5hG2期的比例最高为58.38%。结果提示,就绒山羊的淋巴细胞来说,ConA刺激绒山羊淋巴细胞增殖的效果比PHA好,且摸索出细胞G2/M期的时间点至关重要。

不同采样时间小鼠网织红细胞微核率变化的流式细胞术研究

目的:应用流式细胞术研究两次给药后不同采样时间小鼠外周血网织红细胞微核率的变化,探讨流式细胞术检测微核方法的应用性。方法:NIH小鼠两次腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide ,CP) 4 0mg/kgBW (两次给药间隔2 4h) ,于第二次给药后6、12、18、2 4、30、36、4 8h和72h采外周血- 85℃甲醇固定、PI和CD71染色进行流式细胞术检测,每个样本分析10 0 0 0个网织细胞,同时进行外周血涂片,Giemsa染色显微镜检测,每个样本分析10 0 0个网织红细胞。结果:两次CP给药后6h即可观察到网织红细胞微核率增高,分别在两次给药后2 4h达到高峰,此后逐渐下降。应用流式细胞术检测外周血网织红细胞微核与外周血涂片显微镜检测敏感性相同,两者并具有良好的相关性。流式细胞术检测方法具有高通量、省时、省力等优势。结论:在检测化合物遗传毒性方面,流式细胞术检测方法值得推广应用。

兰州百合同源四倍体诱导及其基因组大小估算

兰州百合(2n=2x=24)是重要的“药食同源”植物,进行其种质创新和基因组大小分析对于丰富其种质资源和生物学信息具有重要意义。以兰州百合的种子和试管小鳞茎为试验材料,通过秋水仙素浸泡诱导染色体加倍,经流式细胞仪倍性检测获得的同源四倍体植株分别有10和4株,四倍体诱导率分别为21.11%和33.27%。为了估算兰州百合基因组大小,以小麦品种“中国春”为内标,通过流式细胞仪测算兰州百合二倍体和四倍体植株中的DNA含量,得出兰州百合基因组为64.9 Gbp,是“中国春”核基因组的4倍。

镉染毒小鼠网织红细胞微核流式细胞术研究

目的 通过流式细胞术 (FCM )检测外周血微核方法 ,研究氯化镉 (CdCl2 )染毒小鼠的外周血含微核网织红细胞率 ,评价流式细胞术在微核检测中的应用价值及探讨氯化镉的致突变作用。方法 采用转铁蛋白受体CD71荧光抗体和碘化丙啶 (PI)染色 ,并以疟原虫感染小鼠外周血红细胞为微核模式生物调校流式细胞仪 ,检测 10～ 6 0mg/kg环磷酰胺染毒和 5 0～ 4 0 0 μg/kg氯化镉染毒对小鼠的外周血含微核网织红细胞率的变化。 结果 不同剂量环磷酰胺染毒小鼠的外周血含微核网织红细胞率和骨髓含微核网织红细胞率均明显高于对照组小鼠 ,且二者之间相关性良好 (r =0 95 5 ) ;不同剂量氯化镉染毒小鼠外周血含微核网织红细胞率未见明显升高。结论 FCM测定外周血含微核网织红细胞率可替代传统显微镜检查骨髓含微核网织红细胞率用于遗传毒性评价 ;在本研究条件下未观察到氯化镉有明显的诱导小鼠外周血含微核网织红细胞形成的作用。

油菜小孢子衍生植株倍性水平及结实性分析

为了研究不同油菜基因型小孢子衍生植株倍性水平差异以及秋水仙碱处理对相应植株结实性能影响,本研究利用三个遗传背景各不相同的F1杂交组合,通过小孢子培养产生再生小苗,经FCM检测比较不同基因型染色体的倍性水平;并根据检测结果,选择性地对再生苗进行秋水仙碱加倍处理,分析不同染色体倍性间加倍率和结实性差异。结果表明:倍性水平显示二倍体的再生苗(自然加倍)约占总数的20%～28%,其中60%～80%可发育成正常二倍体植株,故不需要再行加倍处理;倍性为嵌合体的再生苗占45%～60%,未加倍处理平均仅7%植株可长成结荚正常的二倍体,经加倍处理后结实株率平均可从40%提高到75%;根据植株的结实性分析,对相同基因型的角果性状来说,自然加倍产生的正常植株优于加倍处理后产生的二倍体,但秋水仙碱加倍处理明显促进嵌合体植株的角果发育,平均角果长度增加1.2 cm,角果粒数增多4粒左右。

流式细胞术对小鼠外周血红细胞微核自动化检测的研究

本文报道双激光流式术对小鼠外周血嗜多染红细胞（ＰＣＥ）和成熟红细胞（ＮＣＥ）微核（ＭＮ）的自动化检测新方法。用噻唑橙染ＲＮＡ以区分ＰＣＥ和ＮＣＥ，用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染ＤＮＡ以检测红细胞内ＭＮ。在用ＭＭＣ和ＣＯＬ进行的ＭＮ量效和时效关系研究中，其机检们和镜检结果吻合很好（ｒ＞０．９５），流式仪分选验证，证实其ＭＮ真实性在９５％以上，而检测速度比人工提高４０倍以上。本方法具有高速、精确、客观和完全自动化的特点，标志着流式仪对ＭＮ的自动化检测已达到实用化程度。

秋水仙碱对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖及凋亡的影响

目的研究秋水仙碱对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTCFs)增殖及凋亡的影响。方法体外培养HTCFs,并对传代培养的细胞进行鉴定;采用MTS法检测不同浓度的秋水仙碱对HTCFs增殖的抑制作用;以Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测秋水仙碱对细胞凋亡的影响;使用蛋白质印迹法检测秋水仙碱对凋亡相关蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)、Caspase-9、Caspase-3及active-Caspase-3表达的影响。结果MTS检测显示秋水仙碱对HTCFs具有明显抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。流式细胞术检测发现秋水仙碱作用48 h可诱导HTCFs发生剂量依赖性凋亡,与对照组相比,5μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)的秋水仙碱作用HTCFs的凋亡率分别为(18.37±4.26)%、(33.80±5.02)%及(52.00±2.00)%,差异具有统计学意义(F=91.59,P<0.001)。蛋白质印迹法检测结果显示,秋水仙碱可诱导细胞内凋亡关键蛋白Caspase-3及PARP的活化。结论秋水仙碱可以明显抑制HTCFs的体外增殖,其机制可能与线粒体凋亡途径的激活而诱导细胞发生凋亡相关。

1，3－丁二烯多次吸入染毒后小鼠红细胞微核率的流式仪检测的研究

在本研究中使用作者新近建立的流式仪小鼠红细胞微核自动检测技术和微核常规检测技术，测定了小鼠连续吸入１，３－丁二烯气体５ｄ后（５０，２００，５００和１３００ｍｇ／Ｌ）骨髓和外周血红细胞的微核率变化情况，结果表明１，３－丁二烯能明显诱导小鼠红细胞微核率升高，其剂量反应为非线性增加，但曲线斜率随剂量增加而趋于平缓，由此证明１，３－丁二烯具有肯定的遗传毒性。同时小鼠外周血嗜多染红细胞率随剂量增大而下降，还说明该化合物具有细胞毒性。

毛竹四倍体诱导及初步鉴定

【目的】植物多倍体品种在表型、营养物质含量及抗逆性等方面都具有十分优良的表现,本研究借鉴多倍体育种这一成功的育种方法,旨在突破毛竹新品种缺乏的瓶颈,获得毛竹新品种多倍体的种质资源。【方法】以经浸泡后的毛竹吸胀种子为材料,用不同浓度的秋水仙素进行不同时间的诱变处理。以种子下胚轴膨大为变异植株的早期鉴定标准,并通过流式细胞仪测定细胞核DNA含量鉴定四倍体毛竹,比较分析二倍体与同源四倍体形态学和生理生化方面的特征。【结果】0.5 g·L^-1的秋水仙素就可以诱导吸胀后的毛竹种子的染色体加倍,其中以0.5 g·L^-1的秋水仙素浸泡72 h以及1 g·L^-1的秋水仙素浸泡24 h效果最佳,二者诱导率都可达5%左右;流式细胞仪测定表明,四倍体毛竹叶片细胞DNA相对含量比二倍体增加1倍;与二倍体相比,四倍体植株叶片下表皮的气孔密度显著降低而气孔大小明显增大(P<0.05);四倍体毛竹株高、叶片长度和宽度显著增加,其光合作用优于二倍体植株。【结论】利用秋水仙素处理毛竹吸胀种子,可以成功诱导出四倍体植株,并且四倍体毛竹与二倍体植株的生理生化特点存在显著差异。

流式细胞仪筛选环磷酰胺诱导骨髓嗜多染红细胞微核的技术方法

目的利用单一荧光试剂吖啶橙(acridine orange,AO)和简单的单激光流式细胞仪(FCM)计数骨髓嗜多染红细胞的微核率,达到了解化合物诱导微核作用的目的。方法分别以环磷酰胺(CP)处理雄性KM小鼠和SD大鼠,采用AO荧光染色和单激光流式细胞仪检测小鼠和大鼠骨髓含微核的嗜多染红细胞(MNPCE)及含微核的成熟红细胞(MNNCE)的微核率,并对结果进行比较分析。结果随着CP浓度的增高,骨髓中MNPCE和MNNCE也相应增多,呈良好的量效关系。实验结果同时和手工计数比较,没有显著差异。结论 AO_FCM自动化检测方法完全适用于小鼠和大鼠骨髓MNPCE及MNNCE微核率的检测。

秋水仙素对华北型密刺黄瓜的诱变效应

为探讨适宜华北型密刺黄瓜多倍体诱导技术体系,以黄瓜(2n=2x=14)种子期、萌动种子期和子叶期为试材进行不同浓度秋水仙素处理,通过形态学、细胞学、流式细胞术鉴定,成功获得三倍体(3x)、四倍体(4x)和混倍体(2x+4x/8x+16x)植株,并对二倍体和四倍体黄瓜进行农艺性状和营养品质分析。结果表明,0.4%秋水仙素处理黄瓜萌动种子4 h诱导四倍体的效果最佳,DNA诱变率为18%;0.2%秋水仙素处理黄瓜种子2 h诱导三倍体和混倍体效果最佳,DNA诱变率为15%;四倍体较二倍体节间变短,叶色油亮,叶面积、雌花器官增大,花粉粒呈四孔,染色体、DNA含量加倍,果形指数减小幅度达35.66%,可溶性糖含量和硬度增幅分别为91.74%和34.73%。研究结果为黄瓜多倍体种质创制奠定了技术基础。