补骨脂醇提物UPLC-Q-TOF-MS化学成分分析及促黑色素生成作用机制初探

分析补骨脂醇提物(Psoraleae Fructus alcohol extract,PFE)化学成分并探讨其促黑色素生成作用机制。采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对PFE化学成分进行鉴定;观察PFE对斑马鱼黑色素生成的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)考察PFE、补骨脂素和异补骨脂素对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10中酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyr-related protein 1,Tyrp1)和相关蛋白2(Tyr-related protein 2,Tyrp2)mRNA表达的影响。结果在PFE中共鉴定47个化学成分,其中黄酮类27个,香豆素类10个,单萜酚类8个和其他类2个;发现PFE作用斑马鱼18 hpf(受精后小时,hours post fertilization)后,能明显增加其体内黑色素水平;qRT-PCR结果显示,与对照组相比,PFE能显著增加Tyr和Tyrp2 mRNA的表达,其他给药组均能不同程度地增加Tyr、Tyrp1和Tyrp2 mRNA的表达。

补骨脂配方颗粒提取工艺研究

优选补骨脂配方颗粒最佳水提取工艺,以出膏率、补骨脂素和异补骨脂素总含量及转移率为考察指标,根据单因素考察结果,以煎煮时间、加水量和煎煮次数3个因素设计正交实验方案。结果提取次数和加水量对指标成分的提取率有显著影响,补骨脂配方颗粒的最佳提取工艺为提取3次,加水倍量分别为16/14/14倍,煎煮时间为1.5/1.5/1.5 h。该工艺条件可有效提高补骨脂中两个成分的转移率,可为补骨脂配方颗粒的生产工艺提供一定的参考依据。

黄芪、赤芍配伍补骨脂对大鼠体内补骨脂素和异补骨脂素药代动力学的影响

目的 研究黄芪、赤芍与补骨脂配伍后,补骨脂中主要毒性成分补骨脂素和异补骨脂素的血浆药代动力学参数变化。方法 32只雄性SD大鼠随机分为4组,补骨脂组、补骨脂-黄芪组、补骨脂-赤芍组、补骨脂-黄芪-赤芍组。单次灌胃给药,分别于给药后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h目内眦取血,超高效液相色谱-串联四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法检测血浆中补骨脂素和异补骨脂素的血药浓度,采用DAS3.0软件非房室模型计算药动学参数。结果 补骨脂与赤芍配伍后,大鼠血浆中补骨脂素、异补骨脂素最高血药浓度(c_(max))、药时曲线下面积(AUC_(0-t))显著降低,补骨脂与黄芪配伍后,大鼠血浆中异补骨脂素的c_(max)显著降低,补骨脂与黄芪赤芍三药合用后大鼠血浆中补骨脂素和异补骨脂素的AUC_(0-t)显著降低;异补骨脂素的AUC_(0-∞)和c_(max)显著降低。结论 黄芪、赤芍与补骨脂配伍使用,可以降低补骨脂中主要毒性成分补骨脂素和异补骨脂素的体内暴露量,补骨脂-黄芪-赤芍组大鼠血浆中异补骨脂素平均驻留时间(MRT)延长,其具体作用机制有待深入研究。

HPLC法同时测定补骨脂药材中6种成分的含量

目的:建立同时测定补骨脂药材中6种成分含量的方法。方法:采用高效液相色谱法同时分析补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂异黄酮、补骨脂定和补骨脂查耳酮6种成分。用AlltechC18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,1%冰醋酸溶液和乙腈为流动相,采用梯度洗脱,流速1.0ml/min,检测波长245nm。结果:6种成分线性关系良好,r>0.9991,平均加样回收率均大于95.0%,RSD均小于3.0%。结论:该方法适用于补骨脂药材中6种成分的同时测定,可作为药材质量的综合评价方法。

不同产地补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定

应用高效液相色谱法 ,测定了不同产地补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量。色谱柱为Kromasil C18( 4 6mm× 2 5 0mm ,5 μm) ,流动相 :甲醇 水 ( 4 5∶5 5 ) ,检测波长 :2 4 5nm ,流速 :1 0ml/min ,柱温 :35℃。结果 :补骨脂素在 0 0 4 4 8～ 0 4 4 8μg(r =0 9999)范围内、异补骨脂素在 0 0 35 6～ 0 35 6 μg(r =0 9997)范围内线性关系良好 ,补骨脂素和异补骨脂素平均回收率分别为 98 6 9% (RSD =1 97% )和 10 1 0 9% (RSD =3 0 6 % )。

补骨脂炮制前后化学成分的变化

目的:从炮制前后补骨脂素、异补骨脂素和微量元素含量的变化探讨补骨脂炮制的物质基础。方法:采用HPLC梯度洗脱法、电感藕合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)分别测定了补骨脂炮制前后的补骨脂素、异补骨脂素及六种微量元素的含量。结果:炮制使补骨脂中的微量元素Mn、Ca、Mg、Fe、Zn含量增加,但Cu含量变化不明显;补骨脂素、异补骨脂素含量增加。结论:炮制使补骨脂有效成分含量增加,提高了中药补骨脂整体生物活性。

超临界流体萃取法测定补骨脂中的主要成分

采用超临界流体萃取(SFE)技术和CGC技术测定了中药补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素。对超临界流体萃取过程中影响萃取效率的主要因素采用正交设计法和方差分析法进行了考察,确定了主效应和适宜的操作条件。与传统的萃取法比较,SFE具有经济、快速、简便、选择性好、环境污染小等优点。

补骨脂药材不同有效部位中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定

目的建立高效液相色谱测定补骨脂不同有效部位中补骨脂素和异补骨脂素含量的方法。方法高效液相色谱法。Kromasil RP-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:甲醇-水(65∶35);流速:1.0mL·min-1;检测波长:245nm。结果补骨脂素进样量在10.5ng～525ng,异补骨脂素进样量在9ng～450ng内线性关系良好;相关系数:补骨脂素r=0.9993,异补骨脂素r=0.9999。不同有效部位中补骨脂素和异补骨脂素的含量有差别,其中乙酸乙酯部位(C)中含量最高,正丁醇部位(D)和水部位上清液(E)中含量很低。结论该法操作简便,结果准确,重现性好。

响应面法优化超声波法提取补骨脂中活性成分的工艺研究

以补骨脂素与异补骨脂素总得率为考察指标,优化超声波法提取补骨脂中活性成分的工艺。选取提取时间、液料比和超声波功率为随机因子,在单因素试验的基础上,进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验设计,以补骨脂素和异补骨脂素总得率为响应值进行响应面(RSM)分析,优化超声波法提取补骨脂中活性成分提取条件。结果显示,超声波法提取补骨脂中活性成分的最佳条件为:提取时间47.5 min,液料比5.6∶1(mL∶g),提取液20 mL,提取功率330 W,在最佳的提取条件下,补骨脂素和异补骨脂素总得率理论值为1.043%,验证值为1.047%,验证值与理论值间的相对误差为0.384%,验证值与真实值相吻合,说明响应面法优化补骨脂中活性成分超声波法提取条件可行。

补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素测定

目的根据《欧洲药典》质量标准要求,改进补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的HPLC测定方法。方法补骨脂以甲醇提取,YMC-Triart C18色谱柱（4 mm×250 mm,5μm）,流动相为乙腈-水（35∶65）,等度洗脱,体积流量为1 m L/min,检测波长为246 nm。结果补骨脂素和异补骨脂素在10~100μg/m L范围内成线性,并在Merck-Li Chrospher RP-18（4 mm×250 mm,5μm）和Waters Spherisorb ODS2 column（4 mm×250 mm,5μm）色谱柱上可重复实验结果,两成分的定量测定结果偏差分别为1.50%和1.33%。7个省和缅甸产共16批补骨脂样品中的补骨脂素和异补骨脂素含有量在1.11%（云南）和0.29%（广西）之间。结论建立的方法可符合欧盟植物药申报专属性、精密度（日间、日内）、准确度的要求。

补骨脂有效成分提取工艺的考察

目的:筛选并优化中药补骨脂提取工艺。方法:以补骨脂素、异补骨脂素含量为考察指标,采用浸提法、回流法、超声法、索氏法对中药补骨脂进行提取,应用高效液相色谱法进行含量测定,得到最适提取方法,并以补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂素和异补骨脂素总含量以及出膏率为考察指标,对其最适提取方法进行优化。结果:应用回流法提取时补骨脂素、异补骨脂素含量较高,溶剂浓度和提取时间对实验结果影响较大。结论:回流法为提取补骨脂素与异补骨脂素的最佳方法;4倍量乙醇,提取2h,乙醇浓度为80％为最佳提取条件,且回流提取工艺操作简单,提取效率高。

补骨脂盐炙与盐蒸炮制工艺比较研究

目的:比较补骨脂盐炙品和盐蒸品中2种指标性成分的含量,筛选更优的炮制工艺。方法:在固定盐与药材质量比为1∶50、加水量为盐的4~5倍、盐水闷润时间为2 h的条件下,分别考察补骨脂在温度150、170、190℃下分别炒10、12、14 min的盐炙品和蒸制1、1.5、2、2.5 h后的盐蒸品中指标性成分补骨脂素和异补骨脂素的含量,比较两种炮制工艺的效果。结果:在固定条件下,指标成分的含量在盐炙品中以150℃下炒制12 min者最高,在盐蒸品中以蒸制1 h者最高;盐蒸品中的含量(1.49%)高于盐炙品(1.29%)(P=0.011)。结论:根据炮制品指标性成分含量的比较,补骨脂盐蒸法优于盐炙法。

盐补骨脂含量测定方法的研究

目的建立盐炙补骨脂的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定盐补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量。色谱条件:流动相为甲醇-水(55∶45);检测波长为246nm;流速为1.0ml.min-1;柱温为25℃。结果补骨脂素进样量在0.0814～1.6280μg(r=0.99999),异补骨脂素进样量在0.0812～1.6240μg(r=0.99999)范围内,线性关系良好。结论该法简便、准确,重复性好,可用于盐补骨脂的含量测定。

快速测定不同市售补骨脂药材中补骨脂素、异补骨脂素的含量

目的:建立简便、快速的检测补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素含量的方法,并测定不同市售补骨脂药材中补骨脂素、异补骨脂素含量。方法:采用C18ODS色谱柱(1.8μm,4.6 mm×50.0 mm),流动相乙腈-水(3565),流速0.5 mL.min-1,检测波长246 nm。结果:5 min内补骨脂素、异补骨脂素分离良好。在相应浓度范围内2种化合物的线性关系良好,r>0.999 7;精密度RSD≤2.5%;平均加样回收率为98%。结论:该方法节省了分析时间和溶剂,为补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素的分析提供了一种简便快速的新手段。

超临界流体色谱分离纯化补骨脂中的异补骨脂素和补骨脂素

建立超临界流体色谱(SFC)分离纯化补骨脂中异补骨脂素和补骨脂素的工艺方法。采用YMC-C18、YMC-Diol和YMC-NH2等3种色谱柱,甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇等4种改性剂,流动相流速2~6 mL×min^-1、温度300~325 K、压力10~14 MPa条件下,考察了异补骨脂素和补骨脂素的纯化效果。放大得到制备型SFC条件为:色谱柱YMC-Diol;流动相为含有j=2%甲醇的超临界二氧化碳,流速14.0 mL×min^-1;分离温度313 K;压力12 MPa。结果表明,分离得到的异补骨脂素和补骨脂素的纯度均大于98%,由Van’t Hoff曲线可知实验条件下SFC分离过程为焓控过程。

高速逆流色谱法对补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的分离纯化研究

补骨脂素和异补骨脂素是中药补骨脂的特征成分,含量较高且具有多种生物活性,目前已成为补骨脂及其产品的质量控制成分。本文以补骨脂干燥成熟果实为原料,经乙醇回流制备补骨脂粗提物,率先采用高速逆流色谱技术进行分离,所得样品由高效液相色谱检测纯度,并由对照品确定成分。实验结果表明:采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:5)作为两相溶剂体系,经一步逆流分离可以从补骨脂粗提物中分离得到补骨脂素和异补骨脂素,二者纯度分别达到99.4%、99.1%。该法具有制备量大、分离效率高等优点。

补骨脂有效成分在大鼠血清、肝、肾中的测定

目的建立大鼠血清、肝脏、肾脏中补骨脂素、异补骨脂素定量测定的方法。方法采用乙酸乙醋-正己烷（8：1）为萃取溶剂进行样品处理，采用HPLC法测定，色谱柱AgilentTC—C18（2）（4．6mm×250mm，5μm）；以氯霉素为内标物，流动相为水-乙腈，梯度洗脱，体积流量1mL／min，柱温30℃，检测波长295nm（0—10min，氯霉素），246nm（10～25min，补骨脂素、异补骨脂素）。结果补骨脂素、异补骨脂素在0．1～10．0mg／L范围内，在血清、肝匀浆液、肾匀浆液中均能达到很好的分离。结论本方法简便准确，可同时测定给药后大鼠血清、肝脏和肾脏中补骨脂素和异补骨脂素。

深加工对补骨脂浸出物及其补骨脂素、异补骨脂素含量的影响

目的:改进补骨脂加工炮制方法。方法:将补骨脂用自制轧药机轧扁至裂开,与未轧的药材分别加水或乙醇提取,以水或醇溶性浸出物量及其补骨脂素、异补骨脂素含量为考察指标,用高效液相色谱法测定,条件为:Supelco ODS C18柱,柱温30℃,流动相为甲醇-水(43∶57),检测波长为246 nm。结果:在相同条件下,补骨脂轧扁样品的水或醇溶性浸出物量及其补骨脂素、异补骨脂素含量均比未轧的整粒高,其中,水溶性浸出物增加了0.61倍,醇溶性浸出物增加了1.53倍,水溶性及醇溶性浸出物中补骨脂素、异补骨脂素含量均增加了1.22倍,两者得率悬殊,差异显著。结论:补骨脂经轧扁法加工后能显著提高浸出物量及其有效成分的提取率,增进临床疗效,方法合理,值得推广。

补骨脂叶中补骨脂素和异补骨脂素研究

通过研究补骨脂叶中是否含有补骨脂素和异补骨脂素,寻找含此类活性成分的新药源。分别采用四种不同的浸提方法对补骨脂叶甲醇溶液进行高效液相色谱分析,结合紫外光谱比对,发现补骨脂叶中含有补骨脂素类成分,且不同的处理方法使化学成分发生了显著的量变。新鲜补骨脂叶中补骨脂素和异补骨脂素以及另外两种化学成分的含量均明显高于烘干、晾干、研磨的叶子,补骨脂叶在干制过程中此四种化学成分的含量显著降低。

补骨脂中呋喃香豆素类物质的积累规律及组织定位

应用高效液相色谱技术,分析了补骨脂(Psoralea corylifolia)不同器官、不同发育时期补骨脂素和异补骨脂素的含量变化规律。2种呋喃香豆素类物质在补骨脂的根、茎、叶、花、果实和种子中均有积累,其含量在果实中最高,根中最低,幼嫩茎叶高于成熟茎叶,成熟期果实高于幼嫩期果实。通过组织化学和荧光显微技术对呋喃香豆素类物质的定位研究,同时结合分泌腔的系数与2种呋喃香豆素的含量相关性分析,证明补骨脂中分泌腔是2种呋喃香豆素积累的主要场所。