源于中国东海的有毒裸甲藻Karlodinium micrum的显微观察和分子鉴定

首次报道了在中国东海海区两个不同水样中获得的有毒裸甲藻赤潮种Karlodinium micrum的显微观察和分子鉴定。两株K.micrum纯系种质是对两次东海海区不同来源的水样(2005年6月东海洞头海区以米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)为优势的赤潮水和2006年4月东海渔山海水自然生态保护区的水样)进行选择演替和纯种分离发现的。报道了对两株藻进行光学显微镜和扫描电子显微镜观察结果,以及基于ITS基因测序的分子鉴定结果。显微观察发现,K.micrum为小型单细胞裸甲藻,细胞长略大于宽,平均长宽分别为7.1μm和5.7μm,横沟深裂,顶沟明显、直裂。细胞具有一条纵鞭毛和一条横鞭毛,细胞游动迅速。ITS基因测序发现,源于东海的两株K.micrum与GenBank中Karlodinium micrum的相似度为98～99%。系统发生分析显示,该两株K.micrum与GenBank中Karlodinium micrum归于一类,与其它裸甲藻距离较其与具甲板甲藻的距离近。

微小卡罗藻(Karlodinium micrum)共附生微生物抗菌与细胞毒活性

【目的】本文对微小卡罗藻共附生微生物进行分离并对其抗菌和细胞毒活性进行初步研究,以期望获得既具有抗菌又具有细胞毒的高活性菌株,为从共附生微生物的角度去研究微小卡罗藻毒素的合成途径以及真正来源提供研究材料。【方法】利用琼脂扩散法和MTT法对细菌培养液的乙酸乙酯提取物进行抗菌和细胞毒活性筛选,并对具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16S rRNA系统发生学分析。【结果】在分离到的38株海洋细菌中,25株细菌具有抗菌活性,5株细菌(W-14-2、W-2-2、W-12、E-8-2和W-4)具有细胞毒活性。对这5株具有细胞毒活性的细菌菌株进行16S rRNA系统发生学分析显示它们分别与Alteromonas alvinellae、Stappia aggregata、Pelagibaca bermudensis、Marinobacter kribbensis和Maribacter dokdonensis的16S rRNA基因序列具有较高的相似性。【结论】在分离到的微小卡罗藻共附生微生物中含有较为丰富的活性菌株,且获得5株具有抗菌活性又具有细胞毒的高活性菌株。

微小卡罗藻溶血活性的生长期特征及其溶血毒素种类分析

研究微小卡罗藻的生长曲线及不同生长期藻细胞提取液和去藻上清液溶血活性的大小,通过乙酸乙酯和Bligh-Dyer两种方法提取溶血毒素,利用柱层析和薄层层析对溶血毒素成分进行初步的分离与分析。结果表明,藻细胞提取液在4个生长阶段中都具有明显的溶血活性,去藻上清液在平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性,延滞期及对数生长期溶血活性很低,表明微小卡罗藻的溶血物质是其自身正常生理代谢产物,且在细胞老化过程中可以释放至水体环境中。两种提取方法都可以将溶血毒素提取出来,进一步的色谱分离和生物活性检测发现微小卡罗藻主要含有3种不同性质的溶血毒素,其溶血作用可能与微小卡罗藻较高含量的多不饱和脂肪酸18:5n3和22:6n3有关。

4种典型有害赤潮原因种的溶血特性研究

对4种典型赤潮原因种的细胞和培养水中的溶血特性进行了研究.藻种分别是:赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)的两个品系,微小亚历山大藻(Alexandrium minutum),东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)和微小卡罗藻(Karlodinum micrum).对各藻类的去藻上清液和超声破碎细胞提取液进行了溶血性检测,发现:几种赤潮种对鲫鱼红血细胞的溶血特性具有种间差异,同藻种的细胞与其培养水中的溶血强度存在差异.具体表现为:赤潮异弯藻具有最强的溶血性,去藻上清液的溶血性(60￣100%)远大于超声破碎细胞提取液的溶血性(30￣60%);微小卡罗藻超声破碎细胞提取液的溶血性(70%)大于去藻上清液的溶血性(30%),且是各藻超声破碎细胞提取液溶血性中最强的;东海原甲藻和微小亚历山大藻溶血性较弱,微小亚历山大藻去藻上清液的溶血性(30%)略大于超声破碎细胞提取液的溶血性(10%),东海原甲藻两部分的溶血性差异不显著.赤潮种类及其细胞内外的溶血特性在一定程度上显示了赤潮原因种在赤潮致害过程中的特征.

新型赤潮种类微小卡罗藻的溶血毒性检测

研究了从浙江海区分离的一株微小卡罗藻(Karlodinium micrum)对鲫鱼动脉血的溶血性,以典型鱼毒性的赤潮异弯藻作为比较,分别就细胞提取液、去藻上清液和细胞悬浮液的溶血性进行了研究。结果发现:同样处理条件下,以1%的Triton X-100作为溶血度100%的指标,微小卡罗藻细胞提取液的溶血度为70%,赤潮异弯藻细胞提取液的溶血度为32%。微小卡罗藻去藻上清液的溶血度为33%,赤潮异弯藻去藻上清液的溶血度大于100%溶血的TritonX-100组。两种藻的细胞悬浮液溶血度接近0。去藻上清液和细胞提取液具有显著浓度相关的溶血特征。在同样藻密度时,去藻上清液的溶血度大于细胞提取液的溶血度。由于微小卡罗藻在形态上容易与无毒的河口裸甲藻(Gyrodinium estuariales)混淆,因此,对于该藻的环境危害应当加以重视。对于微小卡罗藻具有溶血性的报道尚属首次。

环境胁迫对微小卡罗藻溶血毒素分泌的影响

在实验室条件下,利用溶血实验将培养于不同盐度、pH、温度和光照强度下微小卡罗藻的培养液做溶血检测,探讨不同环境因子胁迫下微小卡罗藻溶血毒素的分泌情况.结果表明:适宜盐度下该藻分泌少量溶血毒素(2hHs30=2.1%),高盐或低盐胁迫下分泌较多(2hHs50=134.7%,2 hHs20=38.8%).pH<7及pH>9时,分泌的溶血毒素较多(2 hHp5=101.7%,2 hHp10=107.4%);pH在7～9之间,分泌很少(2 hHp7=1.5%).高温胁迫能促进溶血毒素的分泌(2 hHt50=70.7%),适宜温度下不分泌溶血毒素.短时间内(48h),随着光照强度的增加(0～20000lx),该藻的生长不受影响,溶血毒素分泌很少.因此,溶血毒素的分泌与该藻的生长环境密切相关,一旦生长受到抑制,毒素分泌量就会明显增大.

非无菌培养的微小卡罗藻次生代谢产物的细胞毒及其宏基因组酮基合成酶基因的筛选

目的:检测微小卡罗藻(Karlodinium micrum)粗提物的细胞毒活性,筛选其KS基因。方法:非无菌条件培养微小卡罗藻,用乙酸乙酯提取其粗产物,以脐静脉内皮细胞(HUVEC)为目标细胞,测定粗提取物的细胞毒活性;运用分子生物学方法对多聚酮合酶(PKS)基因的酮基合成酶(KS)基因进行筛选,运用BLAST进行比对和系统发生树进行分析。结果:微小卡罗藻培养液粗产物具有细胞毒活性,IC50值为70.8μg/mL。KS基因筛选获得680 bp的片段,并经测序推导出其氨基酸序列,该氨基酸序列与纤维多囊菌和点型念珠蓝细菌KS域的氨基酸序列同源性分别为60%和57%。结论:首次从非无菌培养的微小卡罗藻中筛选到PKS中KS域基因片段,为从中分离聚酮类化合物提供了基因学的依据。

pH及光照对两种赤潮甲藻种群生长和胞外碳酸酐酶活性的影响

研究了pH和光照强度对两种赤潮甲藻(Prorocentrum donghaiense和Karlodinium micrum)的种群生长及其胞外碳酸酐酶(CA)活性的影响。结果表明,pH 7.5、光照强度30μmol/(m2.s)是两种微藻的最适种群生长条件,在种群生长的最适pH和光照强度下,胞外CA活性最大。最适培养条件下,两种甲藻胞外碳酸酐酶活性随着种群生长周期而变化,指数生长期至平台期CA酶活增加,平台期至衰退期CA酶活降低,平台期胞外CA活性最大。