脂肪酶Palatase M.miehei的固定化及催化菜籽油水解研究

采用10种树脂对脂肪酶Palatase M.miehei进行了吸附法固定化,并将其用于催化菜籽油水解.结果发现,大孔吸附树脂LX-8的固定化效果最好,固定化率达91.2%,其得到的固定化酶(IM-PM)酶活为731.1U/g.经米氏常数测定,相比游离酶而言,IM-PM的米氏常数增大,反应速率降低;采用IM-PM催化菜籽油水解,得到了最适水解工艺为:反应时间3h、底物摩尔比(水/油)70∶1、搅拌转速250r/min、温度55℃、加酶量1.5%,最终水解液酸价可达83.2mg·KOH/g.经重复使用6次,IM-PM残余催化活力仍可达70%.

米黑毛霉(M.miehei)天冬氨酸蛋白酶的研究

用硫酸铵分部盐析及离子交换层析技术从米黑毛霉半固体培养物的浸提液中提纯了天冬氨酸蛋白酶,酶活力收率为19.5％,,比活力达3080SU/mg蛋白,提纯8.5倍。用聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-凝胶电泳、等电聚焦、双向免疫扩散及免疫电泳等方法鉴定该酶均一。本文还报道了关于该酶生化性质、动力学性质及化学修饰的研究结果。该酶以天冬氨酸为其活性的必需基团,系一典型的天冬氨酸蛋白酶。

游离DHA酯化富集的脂酶催化工艺研究

研究了脂酶催化游离DHA和甘油酯化的工艺。结果表明:以Rhizomucor miehei脂酶催化的一步法工艺的最适条件为FFA∶甘油=1∶3、脂酶量1%和水分5%,其酯化率、三酰甘油(TAG)含量和TAG中DHA富集量分别为71.6%、22.98%和47.53%;以Rhizomucor miehei脂酶催化的二步法工艺和以Rhizomucor miehei脂酶、Alcaligenes sp.脂酶共同催化的混合酶法工艺不能改变TAG中DHA的百分含量,但可显著提高反应的酯化率和TAG含量。其中,二步法工艺可将酯化率和TAG含量分别提高到84.66%和91.86%,而混合酶法工艺则可分别将其进一步增加到97.68%和93.39%。

米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。

米黑毛霉酶凝干酪素生产工艺参数的优化研究

以新鲜牛乳为原料,采用米黑毛霉凝乳酶为凝乳剂,先通过单因素实验研究凝乳酶添加量、Ca Cl2添加量、凝乳p H、凝乳温度对酶凝干酪素得率的影响,然后通过响应面设计进一步优化了米黑毛霉酶凝干酪素生产工艺参数。优化得到的最佳工艺参数为:凝乳酶添加量0.49%、Ca Cl2添加量0.37 mg/m L、凝乳p H6.08、凝乳温度35℃,在此条件下酶凝干酪素的得率可达3.39%。研究结果可为米黑毛霉凝乳酶在干酪素生产中的应用提供参考。

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。

灭黑一号防治水稻后期主要病害的药效研究

[目的]扩大灭黑一号在水稻上的杀菌谱和应用效应。[方法]以枯草芽孢杆菌和井冈霉素为对照药剂,在水稻孕穗期和破口期前5 d各施药一次,研究不同用量的灭黑一号对水稻纹枯病、稻曲病的防治效果。[结果]一次用药后,灭黑一号对纹枯病的防治效果低于对照药剂,且与用量呈反向效应;二次用药后,各处理的防效明显提高,灭黑一号600 g/hm2的防效最高,病株率、病指的防效分别为96.14%、97.50%。灭黑一号防治稻曲病的效果与用量呈正向效应,450 g/hm2以上用量处理的防效在60%以上,大于对照药剂。[结论]灭黑一号在水稻孕穗期和破口期前连续用药两次可以有效防治水稻纹枯病和稻曲病。

丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建

以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaⅠ酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzaeONL1.其培养7天的培养液的上清液在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5U/mL,培养液上清液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱在相对分子质量32 500处有RML的特征条带.这说明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的.

米黑毛霉产凝乳酶固体发酵培养基优化

对米黑毛霉产凝乳酶固体发酵培养基进行优化,以提高凝乳酶的产量,为米黑毛霉凝乳酶的工业化生产提供技术依据。首先通过单因素实验,得到最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为硝酸铵,最佳产酶诱导物为乳清粉。在此基础上通过正交实验进一步优化,得到培养基外加成分的最优组合为葡萄糖浓度2.5%,硝酸铵浓度1.0%,乳清粉浓度2.0%。培养基优化后米黑毛霉的凝乳活力达到(3649.52±3.62)SU/mL,比优化前提高了54.5%。

高效絮凝素毕赤酵母表面展示系统的构建

为了获得高效的脂肪酶毕赤酵母表面展示系统,利用来自酿酒酵母絮凝素蛋白Flo1的N端874个氨基酸残基(FS)和C端的1101个氨基酸残基(FL)作为锚定蛋白分别构建了2套载体系统.带有前肽的米黑根毛霉脂肪酶(ProRML)克隆到构建的2套展示载体中,使米黑根毛霉脂肪酶(RML)分别以N端锚定或C端锚定的方式实现在毕赤酵母细胞表面的展示.利用RMLC端的Flag标签,通过流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜检测2套系统中RML在酵母表面的展示情况.研究发现,N端锚定于酵母表面的展示酶FSR以pNPC为底物时,水解活力达到了105.3U/g,大约为C端锚定的展示酶FLR活力的2倍.同时FSR比FLR具有更宽的温度、pH作用范围和更好的热稳定性.与游离酶和固定化酶相比,展示酶FSR也表现出更为优良的热稳定性.结果提示,基于Flo1N端锚定的展示系统更适合展示活性中心近C端的脂肪酶,推动了展示酶的进一步研究和开发.

米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析

以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)为出发菌株,采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出米黑根毛霉脂肪酶(RML)结构基因。构建真核重组表达质粒RML-pPIC9K,电转化His+缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达。结果表明,RML基因能够在巴斯德毕赤酵母中实现高效表达。重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了与预期大小(约39 kD)一致的蛋白表达特异条带,用NaOH滴定法测其活性,酶活可达84 U/mL。

米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造

米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的合成活性、热稳定性、溶剂耐受性以及sn-1,3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点。本研究通过密码子优化改造RML编码基因,并将其克隆、转化到毕赤酵母GS115菌株,经诱导发酵156 h,酶活达到3.77 U/mL。为了进一步改善RML脂肪酶的重组表达,通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2酶切位点,结果显示:RML突变体表达量均显著低于野生型的RML脂肪酶,表明"-Arg196-Arg197-"序列并不影响RML的重组表达。通过对RML蛋白结构分析,Kex2酶切位点的肽键被包埋在蛋白内部,这表明该位点区域的折叠在进入分泌途径时已基本完成。本研究对异源蛋白的酵母重组表达具有一定参考价值。

两嗜热真菌中国新记录种

在对山东、陕西及云南的标本研究中鉴定出两个嗜热真菌中国新记录种 ,即亚拉巴马枝顶孢 ,米黑根毛霉 ,对其进行了描述和讨论。亚拉巴马枝顶孢的主要特征是其深色菌丝、瓶梗产孢及顶生分生孢子 ;米黑根毛霉的主要特征是产生带假根孢囊梗 ,单孢子培养产生大量接合孢子。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

固定化米黑根毛霉脂肪酶的制备工艺优化及其酶学性质

以海藻酸钠-羧甲基纤维素钠(CMC)为复合载体,戊二醛为交联剂,探究了包埋-交联法制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件,并对固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质进行分析。结果表明,制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件为海藻酸钠质量分数2.5%、CMC质量分数1.5%、脂肪酶液浓度800 U/mL、CaCl_(2)质量分数5%、戊二醛质量分数0.03%、交联固定化时间30 min,在此条件下固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶活力为245.58 U/g,与游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶热稳定性和pH稳定性均有所提高。交联剂戊二醛的添加可以提高固定化脂肪酶的操作稳定性和储存稳定性,在重复使用7次后相对酶活力保持在57.39%,在4℃下存放7周后相对酶活力为61.89%。包埋-交联法制备的固定化米黑根毛霉脂肪酶具有更好的稳定性和适应性,为实现植物油酶法酯化脱酸工业化生产提供参考。

米黑毛酶提高大豆分离蛋白泡沫稳定性的研究

通过测定不同水解pH条件、不同水解时间、不同搅打起泡pH条件下大豆分离蛋白（SPI）的泡沫稳定性，结合SDS-PAGE分析，水解度分析及蛋白分子表面疏水性分析，为利用米黑毛酶水解大豆分离蛋白制备高泡沫稳定性大豆蛋白制品提供一定的理论依据。显示结果表明：SPI经米黑毛酶在pH3．5处水解45-60min后，回调pH至5．0搅打起泡的泡沫稳定性最优；随水解时间增长，SPI的泡沫稳定性有不同程度提高。通过酶解作用，伴随SPI的蛋白分子量减小，蛋白分子表面疏水性增加，泡沫的稳定性显著提高。

米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。

产凝乳酶米黑毛霉的诱变育种研究

以产凝乳酶的米黑毛霉为出发菌株,通过紫外线照射、紫外复合氯化锂处理,以筛选产凝乳酶活力较高的菌株。确定的紫外线最佳照射时间为90 s,经多次诱变,筛选得到了突变株UV-13,其凝乳酶活力为2448.98 SU/m L,比出发菌株提高了42.85%;复合诱变的最佳条件为90 s紫外照射复合1.5%氯化锂,在多次诱变的基础上,筛选得到了突变株UV-Li Cl-6,其凝乳酶活力为2703.58 SU/m L,比出发菌株提高了57.70%。传代实验表明,两株突变菌都具有良好的遗传稳定性。

米黑毛霉凝乳酶制备切达干酪的工艺参数优化

为确定米黑毛霉凝乳酶制作切达干酪的最佳工艺条件,以感官评分和出品率为响应值,在单因素试验的基础上,采用响应面法对主要工艺参数进行了优化。试验得到的米黑毛霉凝乳酶制作切达干酪的最佳工艺参数为:酶添加量为2900.38SU/L、凝乳pH为6.2、CaCl_2添加量为0.04%、凝乳温度为34℃、发酵剂添加量为0.14%;在此条件下,干酪感官评分为(95.2±0.34),试验结果与预测值接近,证明模型拟合程度较好。

Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated Genetic Transformation System for Aspergillus awamori

[ Objective ] This study aimed to establish Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system for Aspergillus awamori and investigate the feasibility of expressing heterologous proteins in A. awamori. [ Method] Appropriate A. awamori host strains were determined according to the secretory protein profile. Selectable marker was selected for genetic transformation by drug sensitivity analysis. The established A. awamori genetic transformation system was used for transformation and expression analysis of Rhizomucor miehei lipase （RML）. The feasibility of using A. awamori to express heterologous proteins was investigated by identification of transformants and property analysis. [ Result~ Based on the analysis of secretory protein profile, A. awamori strains CBS115.52 and CICC2257 were determined as the host strains for heterologous protein expression ; drug sensitivity analysis shows that hygromycin B resistance gene （ HygBr ） is an effective ge- netic seleetable marker; by using Agrobacterium tumefaciens-mediatcd transformation （ATMT） method, the plasmid pHGW-amdS containing HygBr was successfully transformed into A. awamori strain CBS115.52 to establish the genetic transformation system ofA. awamorl with HygBr as selectable marker. RML was transformed into A. awamori and its expression was validated by substrate hydrolysis test, SDS-PAGE and Western blot. [ Conclusion] This study demonstrates that the genetic transformation system of A. awamori mediated by Agrobacterium tumefaciens has potential feasibility for expression of heterologous proteins.