miR-192-5p在增生性瘢痕组织及成纤维细胞中的表达及调控

背景:研究表明,miRNAs的表达与肝纤维化、肾纤维化及皮肤纤维化发生有关;并证实在痛风性关节炎中miR-192-5p与表皮调节素存在靶向调控关系。目的:探讨miR-192-5p在增生性瘢痕中的表达及调控作用,并验证miR-192-5p与表皮调节素之间存在靶向调控关系。方法:①在新疆医科大学第一附属医院收集6例增生性瘢痕组织及6例正常皮肤组织,采用qRT-PCR法检测miR-192-5p与表皮调节素mRNA表达。②组织块法获取原代增生性瘢痕成纤维细胞,传代培养至3-6代用于后续实验,实验分为3个组:阴性对照组、miR-192-5p模拟物组和miR-192-5p抑制物组,分别转染对应的序列。采用CCK-8法和EdU试剂盒检测细胞增殖活力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡,qRT-PCR和Western blot法检测表皮调节素、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的基因和蛋白表达,生物信息学网站预测miR-192-5p靶点,双荧光素酶实验验证靶向结合。结果与结论:①与正常皮肤组织及其成纤维细胞相比,miR-192-5p和表皮调节素在增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中均呈高表达(P<0.05或P<0.01);②过表达miR-192-5p后,与阴性对照组比较,细胞增殖能力增强(P<0.05),EdU阳性细胞率增加(P<0.01);抑制miR-192-5p后细胞活力降低(P<0.05),EdU阳性细胞率减少(P<0.05);③过表达miR-192-5p 24 h后,与阴性对照组比较,模拟物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率减小(P<0.05),miR-192-5p抑制物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率增加(P<0.01);④转染48 h后,miR-192-5p模拟物组表皮调节素mRNA及蛋白水平显著降低、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白mRNA及蛋白水平显著增高(P<0.05或P<0.01);miR-192-5p抑制物组上述4项指标呈现相反的变化(P<0.05或P<0.01);⑤Targetscan网站预测表皮调节素与miR-192-5p有潜在结合位点;⑥双荧光素酶实验显示,miR-192-5p能够与表皮调节素靶向结合。结果说明:miR-192-5p过表达可降低表皮调节素的表达,二者可能存在负向调控;提示通过调控表皮调节素可能起到抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用。

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

miR-192、miR-196a表达与HER-2阴性晚期胃癌患者化疗疗效的相关性

目的 观察人类表皮生长因子受体-2(HER-2)阴性胃癌患者肿瘤组织及血清中miR-192、miR-196a表达水平与氟尿嘧啶类联合奥沙利铂化疗方案近期疗效的关系。方法 收集2020年5月~2023年4月济宁医学院附属医院行Xelox方案或SOX方案化疗晚期胃癌患者93例,根据近期疗效分为敏感组及耐药组。对两组患者肿瘤组织及血浆中miR-192、miR-196a表达量进行比较,采用Spearman法分析表达量与近期疗效的相关性。结果 与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-192及miR-196a均过表达[(0.165±0.061)vs.(0.043±0.009)、(0.338±0.084)vs.(0.057±0.021)],差异有统计学意义(t=19.081、31.297,P<0.05)。敏感组患者组织及血浆中miR-192表达均高于耐药组[(0.214±0.066)vs.(0.119±0.058)、(0.137±0.041)vs.(0.069±0.019)],miR-196a表达均低于耐药组[(0.294±0.071)vs.(0.367±0.093)、(0.229±0.065)vs.(0.273±0.072)],差异有统计学意义(t=7.355、10.713、4.110、3.027,P<0.05)。miR-192表达与化疗敏感度呈正相关,组织及血浆表达相关系数分别为0.577、0.482,miR-196a表达水平与化疗敏感度呈负相关,组织及血浆表达相关系数分别为-0.474、-0.413。患者胃癌组织及血浆中的miR-192、miR-196a呈正相关,相关系数分别为0.784、0.698。结论 HER-2阴性胃癌患者肿瘤组织及血清中miR-192表达水平与SOX、Xelox化疗方案近期疗效正相关,miR-196a的表达水平与SOX、Xelox化疗方案近期疗效负相关。检测血浆miR-192和miR-196a的表达有可能实现耐药的动态监测。

miR-192对结直肠癌细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探究微小RNA-192(miR-192)对结直肠癌(CC)细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 分别设立A组(SW1116 CC细胞转染生理盐水)、B组(SW1116 CC细胞转染miR-192模拟物)及C组(SW1116 CC细胞转染miR-192抑制剂)。分别以MTT法检测各组细胞增殖情况,以流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,以划痕实验检测细胞迁移能力,以Transwell实验检测细胞侵袭能力。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组细胞miR-192及WNT家族成员2B(WNT2B)mRNA表达水平。结果 B组SW1116 CC细胞存活率、单克隆形成数目分别为(57.32±6.19)%、(284.59±15.08)个,均低于A组的(76.21±8.23)%、(601.47±23.16)个与C组的(89.52±10.62)%、(2 150.68±34.79)个,而凋亡率为(20.52±2.52)%,高于A组的(13.78±1.62)%与C组的(11.62±1.41)%;C组SW1116 CC细胞存活率、单克隆形成数目均高于A组,而凋亡率低于A组(均P<0.05)。B组SW1116 CC细胞划痕宽度为(785.10±46.18)mm,高于A组的(601.32±33.21)mm与C组的(326.99±17.48)mm,而C组划痕宽度低于A组,B组穿膜细胞数为(624.67±19.05)个,少于A组的(875.23±27.30)个与C组的(1 204.17±34.59)个,且C组穿膜细胞数多于A组(均P<0.05)。B组SW1116 CC细胞miR-192 mRNA相对表达水平为(3.01±0.26),相较于A组的(1.87±0.20)及C组的(0.97±0.23)均更高,且C组miR-192 mRNA相对表达水平低于A组,B组WNT2B mRNA表达水平为(2.16±0.26),相较于A组的(4.11±0.50)与C组的(6.08±0.72)均更低,且C组WNT2B mRNA表达水平高于A组(均P<0.05)。结论 miR-192可抑制CC的恶性演进,其主要作用机制之一可能与调控WNT2B表达有关。

miR-192-5p及TAMs源性外泌体对人子宫内膜癌细胞裸小鼠成瘤性的影响

目的探究miR-192-5p及肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)源性外泌体对人子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)细胞增殖及成瘤性的影响。方法采用TAMs、阴性模拟物NC转染的TAMs以及miR-192-5p转染的TAMs源性外泌体刺激子宫内膜癌细胞,并分别注入裸小鼠体内,进行肿瘤细胞移植瘤实验。然后测量各组移植瘤的体积,分别采用RT-PCR和Western blot检测肿瘤组织内miR-192-5p、相关激酶(IRAK1)和下游核因子-κB(NF-κB)表达情况,评估上调miR-192-5p的表达水平对EC细胞增殖及IRAK1和NF-κB表达水平的影响。结果TAMs源性外泌体促进肿瘤生长,miR-192-5p过表达可明显缩小肿瘤体积;miR-192-5p过表达抑制了肿瘤组织中IRAK1和NF-κB的表达。结论上调TAMs中的miR-192-5p的表达水平可能通过IRA K1和NF-κB信号通路抑制EC细胞的增殖及成瘤性。

猪miR-192靶向调控Wnt7a基因表达的研究

【目的】鉴定猪miR-192与Wnt家族成员7A(Wnt7a)基因之间的靶向关系,为进一步构建miR-192介导的胚胎通讯提供依据。【方法】使用miRNA pull-down鉴定miR-192和Wnt7a基因间的互作关系;利用生物信息学软件RNAhybrid 2.2预测miR-192和Wnt7a基因3′-UTR的结合位点,构建含有miR-192结合位点的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型基因片段,克隆至双荧光素酶报告基因质粒,通过NotⅠ、XhoⅠ酶切和测序进行鉴定;鉴定成功的质粒分别与miR-192 mimics和mimics NC共转染猪子宫内膜上皮细胞,检测双荧光素酶活性;将miR-192 mimics、mimics NC、miR-192 inhibitor、inhibitor NC分别与构建的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒共转染至猪子宫内膜上皮细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测Wnt7a基因mRNA和蛋白的表达水平。【结果】pull-down结果显示,miR-192 mimics组与其阴性对照组相比,Wnt7a基因相对表达量极显著升高(P<0.01),miR-192 input组相对于其阴性对照组极显著降低(P<0.01);RNAhybrid 2.2软件预测到miR-192种子区与Wnt7a基因3′-UTR存在结合位点(UGACCUA);转染Wnt7a野生型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组相比双荧光素酶活性显著降低(P<0.05),转染Wnt7a突变型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组之间双荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,miR-192 mimics组Wnt7a基因mRNA相对表达量显著低于其阴性对照组(P<0.05),miR-192 inhibitor组显著高于其阴性对照组(P<0.05)。Western blotting结果表明,过表达miR-192极显著抑制了Wnt7a蛋白的表达(P<0.01),抑制miR-192后Wnt7a蛋白的表达量极显著上升(P<0.01)。【结论】miR-192能够与Wnt7a基因3′-UTR发生靶向作用并抑制其表达。研究结果可为今后深入研究miR-192在妊娠着床过程中的调控机制提供理论依据。

糖尿病视网膜病变患者血清miR-20b-3p、miR-192表达与NLRP3炎症小体和预后不良的关系

目的探讨糖尿病视网膜病变(DR)患者血清微小核糖核酸(miRNA)-20b-3p、miR-192表达与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体和预后不良的关系。方法选取2021年1月至2022年3月我院收治的DR患者165例。根据临床分级标准分为增生型DR(PDR)组89例和非增生型DR(NPDR)组76例,另选取同期我院收治的100例单纯2型糖尿病(T2DM)患者纳入T2DM组及100例体检健康志愿者纳入对照组。检测并对比4组血清miR-20b-3p、miR-192和外周血单核细胞NLRP3 mRNA、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA表达、白细胞介素(IL)-1β、IL-18水平。采用Pearson相关性分析DR患者血清miR-20b-3p、miR-192表达与NLRP3炎症小体相关指标的相关性。DR患者出院后随访1年,根据是否发生视力残疾分为预后不良组47例和预后良好组118例,比较预后不良组和预后良好组血清miR-20b-3p、miR-192水平。收集DR患者的临床资料,单因素和多因素Logistic回归分析影响DR患者预后不良的因素。结果对照组、T2DM组、NPDR组、PDR组血清miR-20b-3p、miR-192表达依次降低,外周血单核细胞NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA和血清IL-1β、IL-18水平依次升高(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,DR患者血清miR-20b-3p、miR-192表达与NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、IL-18水平呈负相关(P<0.05)。随访1年,165例DR患者视力残疾发生率为28.48%(47/165)。多因素Logistic回归分析显示,T2DM病程偏长、PDR占比偏高和糖化血红白蛋白(HbA1c)、NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、IL-18水平升高为影响DR患者预后的独立危险因素,miR-20b-3p、miR-192升高为独立保护因素(P<0.05)。结论DR患者血清miR-20b-3p、miR-192低表达,与NLRP3炎症小体激活和预后不良密切相关,可能成为DR患者病情和预后评估的指标。

基于蒙特卡罗模拟散射效应和异质性对高剂量率192Ir近距离治疗剂量分布的影响

目的:探究散射效应和异质性对高剂量率192Ir近距离治疗剂量分布的影响。方法:用MCNP5蒙特卡罗方法模拟Flexisource HDR192Ir放射源的TG-43剂量学参数:剂量率常数Λ、径向剂量函数g(r)、各向异性函数F(r,θ)。基于临床分别构建身体围度差异、偏心、浅表三种非完全散射和组织成分差异、肺插植、腔道插植三种异质性的简化模型,分别计算放射源的径向剂量分布,并通过比较各简化模型和标准模型的同点径向剂量的偏差来评价散射效应和异质性对剂量分布的影响。结果:Λ、g(r)和F(r,θ)模拟值和TPS数据的偏差均小于1%;非完全散射:TPS高估2 cm、5 cm、10 cm处的真实剂量可达约4%、14.8%、16.4%;皮质骨:TPS高估2 cm、5cm、10 cm处的真实剂量约0.7%、1.14%、10%;肿瘤介质:TPS高估真实剂量平均约1.1%;肺介质:TPS高估0.5 cm~6 cm内的真实剂量平均约1.80%,低估6 cm~15 cm内的真实剂量平均约7.77%;肺插植:半径1 cm肿瘤,TPS高估0.5 cm~8 cm内的真实剂量平均约4%,低估8 cm~15 cm内的真实剂量平均约7.8%;腔道插植:半径为1 mm、4 mm、8 mm腔道,TPS低估真实剂量平均约0.75%、1.30%、2.48%。结论:忽略散射效应和异质性会引入显著的剂量误差。临床治疗时,校正患者真实的剂量分布是必要的。

miR-192在肿瘤中的研究进展

miR-192是一种微小RNA,广泛表达于多种组织中,在细胞分化、凋亡和增殖等生物学过程中扮演着重要角色,并受到转录因子和表观遗传学修饰等多种因素的调控。miR-192的表达在不同组织和疾病中呈现差异性,且在肿瘤中起到抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡和转移的作用。miR-192被认为是一种重要的肿瘤基因,在肺癌、乳腺癌、肝癌和结直肠癌中发挥着重要作用。其表达水平的变化可作为潜在的诊断和预后标志物,为这些肿瘤的治疗和预防提供了一定的参考价值。本文探讨miR-192在肿瘤发生、发展及治疗中的作用,揭示其作为肿瘤治疗靶点的潜力。

糖尿病肾病患者血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-192-5p与白蛋白尿短期进展及预后的关系

目的分析糖尿病肾病(DN)患者血清长链非编码RNA KCNQ1反向链/反义转录物1(LncRNA KCNQ1OT1)、微小核糖核酸-192-5p(miR-192-5p)与白蛋白尿短期进展及预后的关系。方法选取2021年4月—2022年12月康复大学青岛中心医院/青岛市中心医院内分泌风湿免疫科收治的DN患者102例为观察组,根据2次检测(间隔6个月)24 h尿白蛋白及SCr水平分为未进展亚组(n=78)和进展亚组(n=24),根据随访1年预后情况分为预后良好亚组(n=84)和预后不良亚组(n=18),选择同期医院健康体检者58例为健康对照组。采用qRT-PCR检测血清LncRNA KCNQ1OT1、miR-192-5p相对表达量;Pearson法分析LncRNA KCNQ1OT1与miR-192-5p的相关性;多因素Logistic回归分析患者白蛋白尿短期进展的影响因素;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清LncRNA KCNQ1OT1,miR-192-5p对患者预后的预测价值。结果与健康对照组比较,观察组血清LncRNA KCNQ1OT1水平升高,miR-192-5p水平降低(t/P=17.619/<0.001、16.120/<0.001);与未进展亚组比较,进展亚组血清LncRNA KCNQ1OT1水平升高,miR-192-5p水平降低(t/P=7.698/<0.001、9.485/<0.001);与未进展亚组比较,进展亚组患高血压比例降低及FPG、HbA_(1c)、BUN、SCr升高,差异均有统计学意义(χ^(2)/P=9.835/0.002,t/P=2.593/0.011、2.356/0.020、4.582/<0.001、3.139/0.002);与预后良好亚组比较,预后不良亚组血清LncRNA KCNQ1OT1水平升高,miR-192-5p水平降低(t/P=7.602/<0.001,9.380/<0.001);LncRNA KCNQ1OT1与miR-192-5p呈负相关(r/P=-0.452/<0.001);高血压、血清LncRNA KCNQ1OT1水平升高为患者白蛋白尿短期进展的危险因素[OR(95%CI)=1.532(1.058~2.219)、1.638(1.100~2.438)],miR-192-5p水平升高为患者白蛋白尿短期进展的保护因素[OR(95%CI)=0.671(0.517~0.871)];LncRNA KCNQ1OT1、miR-192-5p以及二者联合预测患者预后的AUC分别为0.808、0.822、0.896,联合预测显著优于各自单独预测(Z/P=2.030/0.042、2.116/0.034)。结论DN患者血清LncRNA KCNQ1OT1水平升高,miR-192-5p水平降低,两者均为DN患者发生白蛋白尿短期进展的影响因素,且对患者预后具有一定辅助预测价值。

CEP192过表达可作为胃癌患者不良预后的生物标志物并通过调控G2/M期关键蛋白的表达影响肿瘤细胞恶性增殖

目的探讨CEP192在胃癌中的表达情况及其预后价值,进一步研究其对胃癌细胞生物学功能的影响。方法利用公共数据库探究CEP192在胃癌组织中的表达程度,通过免疫组织化学技术进一步验证CEP192在胃癌中的具体表达状态。通过构建Kaplan-Meier(K-M)生存曲线,探究CEP192蛋白表达与胃癌患者长期预后的关联性。同时,利用单因素和多因素Cox回归分析模型,深入分析影响胃癌患者根治术后5年生存率的风险因素。通过受试者工作特征(ROC)曲线分析评估CEP192表达水平在预测胃癌患者术后5年生存率的价值。生物信息学功能富集预测CEP192在胃癌发生发展中可能参与的生物学过程。采用慢病毒干扰及过表达CEP192,CCK-8法检测CEP192对胃癌细胞增殖能力的影响,免疫印迹法检测CEP192对胃癌细胞G2/M期关键蛋白PLK1、CDK1、Cyclin B1的影响。将慢病毒稳定转染的各组细胞接种于裸鼠背部皮下进行裸鼠成瘤实验,在体观察CEP192对小鼠体质量、瘤体大小及G2/M期关键蛋白的影响。结果CEP192在胃癌中高表达且与患者预后不良相关(P<0.05)。多因素Cox回归分析发现,CEP192高表达、CEA≥5 ng/mL、CA199≥37 IU/mL、T3-4期和N2-3期均为影响胃癌患者术后5年生存率的独立危险因素(P<0.05)。GO及REACTOME基因富集分析提示CEP192可能参与细胞周期等生物学过程,GSEA基因集富集分析结果显示CEP192对细胞周期过程呈现正向调控。CCK-8结果示干扰CEP192后MGC-803细胞的增殖能力减弱,过表达细胞增殖能力增强(P<0.05)。免疫印迹结果显示干扰CEP192后PLK1、CDK1、Cyclin B1蛋白表达水平下降,过表达呈上升趋势(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组相比,干扰CEP192小鼠体质量降低,肿瘤体积变小,PLK1、CDK1、Cyclin B1蛋白水平下调,过表达CEP192则呈现相反趋势(P<0.05)。结论CEP192在胃癌组织中高表达,与患者的不良预后相关,其可能通过调控G2/M期关键蛋白的表达影响肿瘤细胞恶性增殖。

DK-2型制动机192电空切换阀故障影响分析及结构改进

DK-2型制动机中192电空切换阀(以下简称“192切换阀”)作为控制闸缸预控风缸或三通阀容积室与作用管沟通的切换部件,其产品质量稳定性直接影响DK-2型制动机空气位时制动缸保压性能、机车小闸制动性能。鉴于此,通过分析不同工况下192切换阀工作原理,结合HXN5B车型实际运用情况,分析192切换阀故障原因,提出产品结构设计方案。试验验证证明,该设计改进方案可提高DK-2型制动机的运用可靠性。

MiR-192靶向负调控Bim表达诱导肺癌顺铂耐药

背景与目的顺铂是非小细胞肺癌化疗的一线药物,但获得性耐药限制了其疗效的发挥。本研究的目的是筛选鉴定与肺癌顺铂耐药相关的microRNAs,探讨其与肺癌顺铂耐药的影响及分子机制。方法应用miRNA芯片及RT-PCR筛选鉴定A549与A549/DDP肺癌细胞间的差异表达miRNAs,将差异表达miR-192转染A549和A549/DDP细胞株,CCK-8检测miR-192对半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,生物软件预测及双荧光素酶报告基因法寻找miR-192的靶基因,RT-PCR及Western blot检测靶基因表达水平在转染前后的变化。结果 MiR-192在A549/DDP中显著高表达,表达量是A549细胞表达量的37.59±0.35倍。在低表达miR-192的A549细胞中过表达miR-192,细胞对顺铂的IC50显著增高,顺铂引起的细胞凋亡率显著降低;反之,在高表达miR-192的A549/DDP中抑制miR-192的表达,顺铂的IC50显著降低,顺铂引起的细胞凋亡率显著增加。miR-192可靶向作用促凋亡基因Bim的3’-UTR,并在转录后水平负向调控Bim的表达。结论 MiR-192通过靶向负调控促凋亡基因Bim表达,诱导肺腺癌细胞株A549产生顺铂耐药,并减少顺铂引起的细胞凋亡。

猪miR-192/-215的组织表达谱及其关键靶基因分析

【目的】在前期通过Illumina Solexa高通量测序技术并结合荧光定量验证筛选出断奶仔猪E.coliF18菌株感染下表达量极显著上调的micro RNAs—miR-192和miR-215的基础上,为了解miR-192和miR-215的组织表达情况,进一步筛选确定miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染的关键靶基因,为探讨miR-192和miR-215调控断奶仔猪E.coli F18感染的分子调控机制奠定基础。【方法】试验采用Real-time PCR方法检测miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪各个组织中的分布情况,同时利用MEGA 5.0分析了其保守性,Target Scan预测miR-192和miR-215的靶基因,并对靶基因分别进行Gene Ontology和Pathway通路的富集分析,进一步利用DAVID对靶基因蛋白进行功能分类,最后将预测的靶基因与课题组前期筛选出的断奶仔猪E.coli F18感染抗性相关的调控基因取交集。【结果】miR-192和miR-215在35日龄梅山仔猪十二指肠和空肠中均高度表达,二者成熟序列在脊椎动物中高度保守。miR-192和miR-215对应的靶基因相同,具有156个靶基因,只在轴突导向通路(axon guidance pathway)显著富集(P-value<0.05)以及25个GO功能中显著富集(P-value<0.05)。靶基因蛋白按功能分为12类,其中信号转导功能的磷蛋白(phosphoprotein)和DNA结合蛋白(dna-binding)占主要部分。靶基因与前期筛选的E.coli F18感染抗性相关的调控基因(GEO登录号:GSE26854)取交集,发现DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3等5个基因为miR-192和miR-215的重要靶基因,其中DLG5为维持小肠上皮细胞结构完整性的重要因子。【结论】miR-192与miR-215是参与维持断奶仔猪肠道正常功能与抗F18大肠杆菌感染的重要因子,DLG5可能是miR-192和miR-215靶向调控E.coli F18菌株感染中关键的靶基因,今后需要进一步验证其能否作为梅山猪抗F18大肠杆菌的有效遗传标记。

HBx基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2周期的影响

目的探讨HBx基因通过调节miR-192的表达影响人肝癌细胞株HepG2周期进展的机制。方法流式细胞仪分析以下3组细胞的周期变化:HepG2/HBx细胞(HepG2细胞稳定转染HBx基因)、HepG2/pcDNA3.1细胞(HepG2细胞稳定转染空载体pcDNA3.1)以及HepG2细胞。3组细胞中miR-192的表达采用Taqman探针荧光定量PCR法检测。流式细胞术观察转染miR-192后HepG2细胞的周期分布变化,SYBR Green荧光定量PCR和Westernblot分别检测miR-192对HepG2细胞p53、CDKN1A mRNA和蛋白表达的影响。结果 3组细胞中,HepG2/HBx细胞G0/G1期细胞比例明显降低[(52.78±4.08)%vs(67.37±4.87)%,(65.08±5.15)%],S期和G2/M期比例明显升高[S期:(25.22±1.84)%vs(19.78±1.26)%,(18.84±1.68)%;G2/M期:(22.00±2.07)%vs(12.85±1.29)%,(16.08±1.44)%]。HepG2/HBx细胞miR-192表达显著下调[(49.1±5.9)%vs(98.0±8.9)%,(100.0±9.1)%]。转染miR-192引起HepG2细胞G0/G1期和G2/M期阻滞,同时p53、CDKN1A mRNA(p53:1.68±0.12 vs 0.90±0.06;CD-KN1A:2.36±0.12 vs 1.05±0.06)和蛋白(p53:3.07倍;CDKN1A:2.82倍)的表达水平亦显著上升。结论 miR-192通过促进p53和CDKN1A表达引起HepG2细胞周期阻滞,而HBx通过下调miR-192加速HepG2细胞周期进程。

重组人对氧磷酶1K192亚型对毒死蜱所致SD大鼠急性肝损伤的保护作用

目的探讨重组人对氧磷酶1K192亚型(r Hu PON1K192)对毒死蜱中毒导致的大鼠急性肝脏损伤的保护作用。方法将健康成年SD大鼠50只随机分为正常组(A组)、r Hu PON1K192对照组(B组)、毒死蜱染毒组(C组)、低剂量r Hu PON1K192预处理组(D组)、高剂量r Hu PON1K192预处理组(E组),每组10只。C、D、E组均给予毒死蜱灌胃,D组在灌毒30 min前予以r Hu PON1K192 4 500 U/kg尾静脉注射,E组予以9 000 U/kg r Hu PON1K192尾静脉注射,A组予以与毒死蜱同体积生理盐水灌胃,B组则单纯予以r Hu PON1K192尾静脉注射。8 h后取血,采用速率法检测谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的活性,采用ELISA法检测苹果酸脱氢酶(MDH)及谷氨酸脱氢酶(GLDH)的活性;取肝脏组织行免疫组化检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达,采用光镜、透射电镜检查超微结构的改变。比较各组之间相关指标的差异。结果比较A组与B组各项指标,差异均无统计学意义(P>0.05)。C组肝功能指标ALT、AST、GLDH及MDH较A组均有明显升高(P<0.01),HIF-1α呈重度表达,电镜与光镜下肝细胞膜、线粒体等出现明显损伤。D组及E组上述指标较A组轻度升高,E组改变程度较D组稍轻,2组各指标相比无统计学差异(P>0.05)。D组及E组上述指标改变较C组轻,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu PON1K192对毒死蜱中毒肝损伤具有保护作用。

miRNA-192对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨抑制microRNA-192(miR-192)在非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂(DDP)耐药性方面的影响及可能机制。方法通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测人肺腺癌耐DDP细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549细胞中miR-192的表达水平,A549/DDP细胞转染miR-192抑制剂(inhibitor)和miR-阴性对照(NC)48h后采用qRT-PCR检测转染效率,分别采用MTT法、克隆形成实验及流式细胞术检测转染48h后A549/DDP细胞对DDP的药物敏感性、细胞增殖能力及细胞凋亡变化,Western blotting检测转染48h后细胞中Bax和Bcl-2的表达变化。结果 miR-192在A549/DDP细胞中的表达水平高于A549细胞(P<0.05);转染miR-192 inhibitor 48h后的A549/DDP细胞miR-192水平低于转染miR-NC者(P<0.05);转染miR-192 inhibitor后,A549/DDP细胞的增殖能力减弱、凋亡细胞增多、DDP对其半数抑制浓度降低、Bax蛋白水平升高和Bcl-2蛋白水平下降,与转染miR-NC者比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抑制miR-192能够降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性,其作用机制可能是通过增加细胞凋亡以及下调Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白表达来实现的。

氟伐他汀联合达格列净对中心性肥胖2型糖尿病患者糖脂代谢及miR-192、miR-26a、miR-221水平的影响

目的探究氟伐他汀联合达格列净对中心性肥胖2型糖尿病(T2DM)患者糖脂代谢及微小RNA-192(miR-192)、miR-26a、miR-221水平的影响。方法选取2018年12月—2020年12月开滦总医院内分泌科收治的中心性肥胖2型糖尿病患者200例作为研究对象,按治疗方法不同分为氟伐他汀组93例和两药联合组(联合组)107例。氟伐他汀组采用氟伐他汀进行治疗,联合组在氟伐他汀组基础上加服达格列净进行治疗。观察2组患者治疗效果,治疗前、后体质量、BMI、腰围、臀围、空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2 hPG)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素细胞功能指数(HOMA-β);采用放射免疫分析法检测治疗前、后血清空腹胰岛素(FINS)、2 h胰岛素(2 hINS)、空腹C肽(FCP)、2 h C肽(2 hCP);全自动生化分析仪检测脂代谢指标;酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清成纤维细胞生长因子21(FGF21)、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)、B型脑钠肽(BNP)水平;实时荧光定量(RT-PCR)检测微小RNA水平。结果治疗后,联合组治疗总有效率高于氟伐他汀组(96.26%vs.88.17%,χ^(2)/P=4.407/0.036);与氟伐他汀组比较,联合组患者体质量、BMI、腰围、臀围,血清FPG、2 hPG、FINS、2 hINS、FCP、2 hCP、HOMA-IR,空腹FFA、2 hFFA、TC、TG、LDL-C,血清FGF21、PTP1B、BNP水平降低(t/P=6.139/0.001、5.145/0.001、4.396/0.001、3.729/0.001、2.997/0.003、3.314/0.001、4.685/0.001、4.399/0.001、6.498/0.001、9.046/0.001、13.860/0.001、4.191/0.001、7.109/0.001、5.543/0.001、4.820/0.001、10.210/0.001、2.326/0.021、11.890/0.001、23.580/0.001),HOMA-β、HDL-C水平升高(t/P=2.600/0.010、6.112/0.001)。与氟伐他汀组比较,联合组miR-192、miR-26a、miR-221水平升高(t/P=18.860/0.001、8.590/0.001、23.040/0.001)。结论氟伐他汀联合达格列净可有效改善中心性肥胖2型糖尿病患者的糖、脂代谢紊乱,降低miR-192、miR-26a、miR-221水平。

下调microRNA-192基因表达对恶性黑素瘤A375细胞增殖及早期凋亡的影响

目的:研究microRNA-192基因表达降低与恶性黑素瘤A375细胞增殖及凋亡的关系。方法:除空白对照组外,运用脂质体介导法将空载体和为microRNA-192设计的small interfering RNA(si RNA)转染到恶性黑素瘤A375细胞中,并利用实时定量PCR检测microRNA-192的表达。通过形态学观察、细胞计数法、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法以及流式细胞免疫学等方法,分析空白对照组、空载体对照组(lipofectamine2000)和实验组恶性黑素瘤A375细胞的增殖和早期凋亡情况。结果:空白对照组和空载体对照组之间相比较,细胞增殖和凋亡情况几乎一致,差异无统计学意义。与空载体对照组相比,实验组存活的恶性黑素瘤A375细胞的活性和数量明显降低,此现象并随着si RNA浓度的提高而愈发明显。另外,实验组恶性黑素瘤A375细胞细胞凋亡指数较空载体对照组明显升高。结论:通过下调恶性黑素瘤细胞中microRNA-192基因表达可能会有效地抑制恶性黑素瘤的生长并促使其细胞凋亡。

microRNA-192抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-192抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡和周期。将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组。实验组采用miR-192抑制物(hsa-miR-192inhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-192的活性。结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01)。随着浓度从50nmol/L逐渐增加至200nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01)。与对照组相比,实验组细胞周期G_0/G_1细胞比例显著增加,G_2/M期细胞比例显著减少,S期细胞比例显著减少(P<0.01)。实验组凋亡率(13.6±2.1)%与阴性对照组凋亡率(7.1±0.5)%相比明显增高(P<0.01)。结论:miR-192抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-192的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用,可能成为骨肉瘤生物治疗的新靶点。