Y-染色体mini-STR分型二代测序技术应用于无创产前亲权鉴定的可行性研究

目的:评价基于Y-染色体mini-STR的二代测序技术(NGS)通过检测孕妇血浆中胎儿遗传物质完成无创产前亲权鉴定的可行性。方法:从24位孕妇外周血中提取游离胎儿DNA(cffDNA),用Illumina NextSeq 500平台对cffDNA同时进行12个mini-STR基因座的NGS测序分型。cffDNA基因分型结果通过胎儿父亲基因型来验证。对每一组的分型结果计算亲权相关参数。结果:对父亲和出生后的婴儿采用常规的毛细管电泳法(CE)做亲子鉴定,证实了24对父亲和胎儿均具有亲子关系。其中13组男性胎儿的cffDNA所有等位基因均与父亲相同,而1组男性胎儿的cffDNA分型在DYS393出现与父亲不同的等位基因,证实为基因突变;10组女性胎儿的cffDNA均无等位基因检出。利用当地人群单倍型频率可以计算累积亲权指数(CPI)和亲权概率。13组无基因突变的男性胎儿的亲权概率为98.269 9%~99.882 8%,基因突变组的亲权概率为14.871 9%。结论:本研究初步证明了基于NGS的Y-染色体mini-STR用于无创产前亲权鉴定具有较高的准确性,可用于部分案件中在不损伤受害人和胎儿的前提下排除无关男性,并且可以将调查范围扩大到胎儿的所有男性生物学亲属。

基于二代测序的mini-STR分型技术应用于无创产前亲权鉴定的可行性研究

目的探讨基于二代测序技术(next generation sequencing,NGS)检测孕妇血浆中胎儿短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因座的方法应用于无创产前亲权鉴定的可行性。方法收集28组家庭样本,首先用毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)法检测每组家庭STR基因型,验证父-母-婴儿的亲子关系。然后,用Illumina平台NGS测序技术检测母亲血浆中游离胎儿DNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的23个mini-STR基因座的等位基因,筛选适合的mini-STR基因座,用于胎儿的亲权鉴定。结果对同一家庭的父亲、母亲和婴儿的STR分型结果证实28组家庭全部具有亲子关系。cffDNA样本的NGS检测结果在排除母亲DNA干扰后,与婴儿CE方法分型结果进行比对,结果显示D5S818、D19S253和D21S1270三个基因座符合率低于50%。针对余下符合率高于60%的20个基因座,将基于NGS的cffDNA的STR分型结果分别与生物学父亲和随机男性进行比对,结果显示两组一致率有显著性差异(P<0.0001),分别为75%~100%和25%~70%。结论基于NGS技术检测cffDNA的STR分型方法可应用于无创产前亲权鉴定。

MiniFiler^(TM)试剂盒在LCN-STR分型中的应用

目的评估MiniFilerTM试剂盒在LCN-STR分型中的法医学应用价值。方法采用MiniFilerTM与IdentifilerTM试剂盒,对49份常量与39份LCN检材,包括血迹、精斑、骨骼等7类常见检材的检验结果进行比较,并对两种试剂盒的检测灵敏度进行比较。结果在49份常量检材的检验结果中,两种试剂盒的STR分型结果全部一致;在39份LCN生物检材的检验结果中,MiniFilerTM试剂盒获得全部STR分型的有30份,部分分型的5份,阴性的4份;IdentifilerTM试剂盒获得部分STR分型的22份,阴性的17份。MiniFilerTM试剂盒检验成功率明显高于IdentifilerTM试剂盒;MiniFilerTM试剂盒的检测灵敏略高于IdentifilerTM。结论MiniFilerTM试剂盒可显著提高LCN生物检材的检验成功率,适合应用于法庭科学实际检案中LCN生物检材的检验鉴定。

12个mini-X-STR和Amel基因座荧光标记复合扩增体系的初步研究

目的研究建立12个mini-X-STR和Amel基因座复合扩增体系。方法选择DXS101、DXS10159、DXS10162、DXS10164、DXS6789、DXS7133、DXS7423、DXS7424、DXS8378、DXS981、GATA165B12和GA-TA31E08共12个X-STR与Amelogenin基因座,自行设计引物,分别采用FAM、HEX、Tamra、ROX四色荧光标记5′端,并进行必要的修饰,按照合适的引物浓度进行混合。对97个血痕样本进行复合扩增,并用ABI3130XL进行电泳和分型。结果所建立的荧光标记复合扩增体系能够得到清晰、明确的分型图谱,灵敏度达50pg,稳定性、重复性与平衡性较佳。结论本研究建立的12个mini-X-STR和Amel基因座荧光标记复合扩增体系统检验方法简单,灵敏度高,适合实际办案的需要。

尿液及尿斑DNA分型的研究

目的研究尿液及尿斑的DNA提取及其检验。方法用Chelex100法及QIAampMiniKit提取尿液及尿斑样本中的DNA,进行PCR扩增及STR检验。结果新鲜的及存放时间在12h以内的尿液样本能得到较好的分型结果;存放2d左右的尿液样本有50%能检出基因型;存放7d及更长时间的尿液样本全部不能检出基因型;尿斑样本的分型成功率很低。结论较新鲜的尿液样本均能进行DNA分型,在法医检案中具有应用价值。

微量口腔脱落细胞检材的DNA检验

目的寻求提高微量口腔脱落细胞检材的DNA检验成功率的简便有效的提取方法。方法对不同载体上的100份微量口腔脱落细胞检材采用小体积Chelex-100法提取DNA,在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行定量,同时用IdentifilerTM复合扩增系统扩增,在ABI3130遗传分析仪上进行STR分型。结果从25根饮料吸管上提取的DNA量在0.72～116.7.8ng,16个水杯杯缘提取的DNA量在2.15-142.5ng,31个饮料瓶(罐)口提取的DNA量在1～34.65ng,10根筷子上提取的DNA量在3.35～26.6ng,12个果核中提取的DNA量在0.294～21.4ng,6份吃剩的骨头中提取的DNA量在0.88～5.88ng。100份检材性别及9个以上STR位点分型成功率平均为59.38%。除了使用者的个人原因外,检材的提取送检方式、检材的质地、饮料的性质对提取的DNA量有显著影响,是否加蛋白酶K对提取的DNA量无显著影响。结论采用小体积Chelex-100法可对60%左右的微量口腔脱落细胞检材提取DNA进行STR分型。

一种简便的STR重复次数测定方法

短串联重复(STR)的多态性分析是生物个体识别最有效的一种手段,在法医学鉴定中已被广泛用于身份识别.但目前使用的方法成本太高,以致不便在更广泛的范围推广.针对法医上常选用的4 bp重复单位的STR基因座,采用PCR产物小于160 bp的迷你STR(Mini STR)和优化聚丙烯酰胺凝胶电泳条件,提高分辨率,使重复单位之间能有效分辨.设计PCR引物,使STR基因座扩增产物的大小为4 bp的倍数,应用8 bp的DNALadder即能精确测定整数倍STR重复单位数.这一方法操作简便,成本低廉,尤其是用于制作人基因身份证,使得人人制作一张基因身份证成为可能.