一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。

建立基于miniSOG标签的光镜-电镜关联方法观察腺病毒Ⅸ蛋白的亚细胞定位

目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白Ⅸ的细胞内定位.方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白Ⅸ与miniSOG的融合基因ⅨSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;通过荧光显微镜确定ⅨSOG蛋白表达的细胞,之后对转染细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内ⅨSOG融合蛋白的表达及分布情况.结果 在蓝光激发下,miniSOG能够发射绿色荧光.定位选择光氧化形成嗜锇颗粒的ⅨSOG表达细胞进行电镜观察,结果显示Ⅸ蛋白在细胞核内多个区域形成点状聚集或包涵体.结论 建立了依赖miniSOG标签的的光镜-电镜关联方法,该方法可用于病毒蛋白细胞内定位研究.

MiniSOG蛋白的单克隆抗体制备及初步研究

单线态氧产生者(mini singlet oxygen generator,miniSOG)是改造于拟南芥向光素2蛋白而获得的小分子荧光黄素蛋白,由106个氨基酸残基组成。miniSOG被广泛用于电镜及荧光显微镜,并被广泛用于发色团辅助的光灭活(Chromophore-assisted light inactivation,CALI)蛋白、DNA或RNA,并结合免疫光敏用于癌症的治疗,以及结合细胞消融用于神经科学、免疫生物学等。但是目前国内并无商品化的miniSOG抗体,为了辅助课题研究,制备抗miniSOG蛋白的单克隆抗体,本研究根据miniSOG基因的ORF区序列构建miniSOG-GST重组蛋白的原核表达载体PGEX-4T-1-miniSOG,然后将该重组质粒转化于BL21感受态大肠杆菌中,异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-DThiogalactoside,IPTG)诱导融合蛋白的表达,并经亲和层析方法进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。筛选获得稳定分泌抗miniSOG的单克隆抗体细胞株,最终选取性能最优的4F9细胞株进行小鼠腹水制备并纯化。单抗4F9亚型为IgG1/Kappa,腹水滴度达到1∶200 000,纯化抗体灵敏度达到5 ng/mL。并通过Western Blot、免疫荧光及免疫组化方法进行特异性鉴定,该单克隆抗体能特异性识别转染细胞和转基因小鼠脑组织中的miniSOG蛋白。本研究在国内首次制备了miniSOG单克隆抗体,将丰富其在其它方面的应用。

“嘎嘣脆”受体--可被单线态氧分子永久激活的G蛋白偶联受体

光敏剂磺酸化铝络酞菁(SALPC)光动力作用所产生的单线态氧分子(1O2),永久性激活分离大鼠胰腺腺泡细胞内源性的和在HEK293细胞异源表达的胆囊收缩素1型受体(cholecystokinin type 1 receptor, CCK1R).基因编码的蛋白质光敏剂(genetically encoded protein photosensitiser, GEPP)毒杀红(KillerRed)、迷你单(miniSOG)在胰腺腺泡肿瘤细胞系AR4-2J质膜定位表达后,光动力永久激活AR4-2J细胞内源性CCK1R.细胞特异性KillerRed或miniSOG光动力作用,有望为阐述CCK1R的生理功能提供直接证据.潜在"嘎嘣脆"受体嵌合体的出现,将可实现对其他G蛋白偶联受体的在体原位远程调控.本文综述了实验室发现"嘎嘣脆"受体(可被1O2永久性激活的G蛋白偶联受体)的相关工作背景和已发表的主要研究结果,展望该领域发展前景,预测"嘎嘣脆"受体在疾病治疗中的可能应用.

利用光镜-电镜关联方法研究发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白的亚细胞定位

目的 通过miniSOG蛋白标记技术观察发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）核蛋白NP在不同时相下的细胞内定位及特点.方法 miniSOG是新发现的能够被电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆SFTSV核蛋白NP与miniSOG融合基因NPSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;之后对不同转染时相的细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内NPSOG蛋白的表达及分布特点.结果 携带NPSOG基因的质粒转染细胞后,核蛋白NP在胞浆及核周表达,并逐渐聚集,连接内质网、高尔基体等细胞器在胞浆中形成体积较大、形状不规则的包涵体样结构,未见其他亚细胞结构改变.结论 SFTSV核蛋白NP单独表达即可形成包涵体,无需其他病毒蛋白协助;包涵体的形成需要一定数量蛋白的定向移动并聚集,这期间可能涉及蛋白与宿主细胞器的相互作用.

鼻病毒非结构蛋白2B引起细胞自噬产生的研究

目的利用miniSOG标签观察鼻病毒非结构蛋白2B蛋白在细胞中定位及自噬体产生。方法将非结构蛋白2B和miniSOG进行融合表达构建pcDNA3.1-2B-miniSOG-flag质粒,将质粒转染HEK293细胞,在荧光显微镜下,2B-miniSOG阳性细胞进行固定、光氧化及超薄切片制备,电镜下观察2B-miniSOG蛋白在细胞中的定位及细胞超微结构变化,Westernblot(WB)检测LC3的表达。结果2B-miniSOG蛋白在荧光显微镜下发出绿色荧光,WB检出自噬标志性蛋白LC3-II表达增加。电镜下观察到蛋白定位于线粒体,细胞中出现大量囊泡样结构,可观察到自噬体和自噬溶酶体。结论鼻病毒非结构蛋白2B可引起细胞自噬发生。