基于Illumina MiSeq高通量测序的燕麦种带细菌多样性及功能分析

采用高通量测序法,分析7份来自不同地区的燕麦种带细菌群落的细菌丰度、Alpha多样性、Beta多样性和物种组成差异,并采用PICRUSt和FAPROTAX功能预测的方法分析了各种带细菌间的丰度差异。结果显示:1)7份燕麦中共获得5187个细菌可操作分类单元(OTUs),主要归属于33个门、180个目和435个属。2)基于OTUs的丰度及注释信息,7份燕麦种带细菌群落中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、放线菌门和蓝菌门为优势菌门,立克次氏体目和鞘脂单胞菌目为优势菌目,鞘氨醇单胞菌属、Solibacter和假节杆菌属为优势菌属。3) Alpha多样性和Beta多样性表明不同燕麦品种的细菌群落多样性和群落结构具有较大差异,其中LXY-5具有最大的Alpha多样性。LEFSe分析更进一步显示不同的燕麦品种生物标记的物种不同。4) PICRUSt和FAPROTAX功能预测分析表明,燕麦种带细菌群落主要有代谢、有机系统和人类疾病3个代谢通路,分属于有42个KEGG和24个COG的二级代谢途径;FAPROTAX功能注释后共获得52个生态功能。研究结果为明确燕麦种带细菌多样性及开发新型基因资源提供了理论依据。

基于Illumina MiSeq的麋鹿粪样菌群多样性分析

为探究麋鹿(Elaphurus davidianus)肠道菌群的结构和组成,为麋鹿消化道疾病防治提供有价值的基础数据,应用Illumina MiSeq对4个麋鹿栖息地32只麋鹿粪便样本的16S rRNA的V3—V4可变区进行扩增,结合样本的OTU种类及丰度,用R软件进行聚类和主成分分析(PCA),并计算多样性指数。结果表明:共获得1 438 677条有效序列,平均每个样品有(44 959±12 153)条有效序列;将序列拼接优化,在97%相似度条件下获得31 459个物种分类的OTUs,平均每个样品为(983±240)个OTUs;平均读长为426 bp。对测序数据注释后共获得11个门和74个属,在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群;优势菌属(相对丰度大于1%)一共有15种,占89%。Alpha多样性物种指数范围区间较大,香农指数为2.42~5.83,辛普森指数为0.007 3~0.148 6,表明不同麋鹿的细菌多样性存在差异。运用主成分分析,将4地的麋鹿粪便样品聚为3个群落,其中石首麋鹿国家级自然保护区、大部分辽宁辽阳千山鹿场样品分别聚在一起,而北京麋鹿生态实验中心、河北滦河上游国家级自然保护区和少量辽宁辽阳千山鹿场样品聚在一起。研究表明,随麋鹿迁出时间的延长,麋鹿肠道菌群聚类分析的远近越明显,可能与迁出地的麋鹿饮食改变有关。

基于Illumina Miseq高通量测序技术探究藏茶发酵过程中微生物菌群变化

应用Illumina Miseq高通量测序技术,研究藏茶毛茶(MC)、发酵阶段(S1~S5)及成品茶(S6)中的微生物的多样性与群落结构,并从成品茶(S7)中分离纯化出三株优势曲霉进行鉴定。结果表明,在S1~S5阶段,真菌丰度和多样性先降低后增加,而细菌丰度和多样性先增加后减少;β多样性分析表明,S1~S5阶段藏茶中微生物组成趋于相近,而毛茶与成品茶均与S1~S5阶段有明显区分。优势真菌为子囊菌门曲霉属,经分离纯化鉴定为冠突曲霉、泡盛曲霉和米曲霉;细菌以变形杆菌、厚壁菌、放线菌和拟杆菌为优势菌,发酵全过程无稳定的优势细菌。

基于Illumina MiSeq技术的冷鲜肉食品微生物群落多样性分析

为了分析冷鲜肉在冷冻过程中微生物群落变化,选取不同冷冻时间的冷鲜肉作为样品,采用Illumina MiSeq技术解析微生物结构,并获取微生物群落多样性分析结果;随着冷鲜肉冷藏时间的增长,样品OTU数量从209下降至98~125。通过分析Chao index与Shannon index的计算结果可知,冷冻时间较短的试验D组具有更高值。冷鲜肉微生物群落结构中,样品中嗜冷菌属和Oceanisphaera的相对丰度超过89%。微生物群落主成分分析时,冷冻时间较短的样本点与冷冻时间最长的样本点,在PC1水平上处于两个极端,菌群结构变化显著。随着冷鲜肉冷冻处理时间的增长,食品微生物群落多样性大幅下降,但是嗜冷菌属与Oceanisphaera作为优势菌数量开始增加。结果表明,在冷鲜肉食品微生物检测过程中,该方法可以获得更加全面的微生物群落多样性分析结果,快速得出冷鲜肉处理过程中影响较大的优势腐败菌,为后期食品质量提升提供依据。

基于Illumina MiSeq技术分析谷子根际丛枝菌根真菌群落多样性

为研究谷子(Setaria italica)根际丛枝菌根真菌(AMF)群落的多样性特征,以便充分发掘和利用AMF优势菌群。本试验对土壤进行正常浇水与干旱处理,土壤含水量分别为7.6%和3.7%,并采集谷子(豫谷、安陵和沁黄3个品种)根系及无寄主对照土壤(CK),获得全部DNA并对其中的18S rRNA基因进行PCR扩增,并运用MiSeq高通量测序技术和生物信息学研究谷子的根际AMF及群落特征。物种多样性分析结果显示,在正常浇水与干旱处理下,谷子根系与CK的OTU数量在1 632~4 290个之间,共检测并鉴定出AMF 126种,隶属1门9属。其中,按优势种的占比高低依次是原囊霉属(Acaulospora)、球囊霉属(Glomus)、类球囊霉属(Paraglomus)和双型囊霉属(Ambispora)。与CK相比,谷子根际AMF群落多样性减少,AMF在原囊霉属水平上丰度显著降低。但正常浇水与干旱处理下,谷子根际AMF群落多样性并未发生显著变化。研究揭示了谷子根际AMF群落组成,主要为球囊霉属;与CK相比,3个谷子品种AMF群落分布在多样性及丰度方面具有普遍的相似性。此外,与正常浇水相比,干旱条件下谷子根际丛枝菌根群落多样性及丰度保持稳定,维持在较高的水平,可保证谷子根系对水分和养分的高效吸收与利用。

基于Illumina MiSeq技术分析腌干鱼加工过程中微生物群落多样性

为研究传统和乳酸菌法加工腌干鱼过程微生物的变化规律,为优化腌干鱼工艺提供理论依据,采用MiSeq测序技术,研究腌干鱼在不同加工阶段的细菌多样性,结果表明:腌干鱼加工过程微生物种类丰富,主要分为三大类:拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变性菌门(Proteobacteria);蓝圆鲹初始菌相中优势细菌为肠杆菌科(Enterbacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcactae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和希瓦氏菌科(Shewanellaceae);海鲈初始菌相中优势菌主要是气单胞菌科(Aeromonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterbacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、摩式摩根菌科(Moraganellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)等。传统腌制加工过程中菌相比较单一,优势菌主要是弧菌科(Vibrionaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和动性球菌科(Planococcaceae);而接种乳酸菌发酵后,加工过程中细菌多样性呈现增加趋势,并且乳酸菌成为优势菌,促进了微杆菌科(Exiguobacteracea),葡萄球菌(Staphylococcaceae)等优势菌的繁殖;此外还检测到气单胞菌(Aeromonadaceae)和乳杆菌(Lactobacillaceae)等传统蓝圆鲹腌制加工过程中没有出现的菌。海鲈在腌制加工过程中细菌多样性明显高于蓝圆鲹,乳酸菌法腌制加工过程中细菌多样性明显增加。

采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性

本试验旨在采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性。选取30窝同日出生、胎次相同和平均窝重相近的健康新生仔兔,于14日龄开始补饲,断奶当日(30日龄)从30窝仔兔中选取48只体重相近的健康幼兔作为试验兔,饲喂不添加抗生素的基础饲粮。分别于断奶当日及断奶后1、2和3周随机选取6只健康幼兔屠宰,无菌采集盲肠内容物,从中选取3个样本提取微生物基因组总DNA,采用Illumina MiSeq测序技术检测其中的微生物群落多样性。结果显示:1)健康幼兔盲肠微生物群落α多样性指数指标(ACE值、Chao1值、Shannnon值)随日龄的增长有升高的趋势(P<0.10)。2)不同日龄健康幼兔盲肠微生物各菌门的相对丰度差异不显著(P>0.05),且均主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门组成;在科水平上,厚壁菌门主要由瘤胃球菌科和毛螺旋菌科组成,拟杆菌门主要由拟杆菌科和紫单胞菌科组成;在属水平上,拟杆菌属、Barnesiella、Akkermansia、普雷沃氏菌属和4种未知菌属为优势菌属;拟杆菌属和Parabacteroides在断奶当天的相对丰度较高,且与其他日龄组差异显著(P<0.05)。3)健康幼兔盲肠中均存在乳杆菌属,且相对丰度在各日龄组间差异不显著(P>0.05)。由此得出,断奶时健康幼兔盲肠微生物区系已基本建立,相对丰度最大的优势菌属为拟杆菌属,但断奶后随着日龄的增长,微生物组成趋于复杂。

基于MiSeq分析川中黑山羊瘤胃细菌的多样性及群落结构

采用MiSeq高通量测序技术分析川中黑山羊瘤胃细菌的多样性及菌群结构。选用3只140日龄健康公羊,其平均体质量为(15.53±0.21)kg,饲喂10 d后,于150日龄时采集瘤胃液(样品A),40 d后再次采集瘤胃液(样品F),提取瘤胃液细菌基因组DNA,对细菌16S rDNA序列V4区进行MiSeq测序。结果显示:1)从样品A与样品F中共获得高质量序列338 830条,聚类后得3 400个运算分类单位(OTU);2)样品A的α多样性指数高于样品F的,但其差异无统计学意义;3)门水平上,样品A最高相对丰度为拟杆菌门的(占总序列数的40.87%),其次为厚壁菌门的(27.19%),样品F最高相对丰度为拟杆菌门的(47.12%),其次为变形菌门的(19.99%),再次为厚壁菌门的(18.05%),样品A厚壁菌门的相对丰度极显著高于样品F的(P<0.01);4)在属水平上,样品A与样品F的最高相对丰度均为普雷沃氏菌属的(样品A的为25.54%,样品F的为27.67%),样品A中月形单胞菌属、丁酸弧菌属、瘤胃球菌属、琥珀酸弧菌属、琥珀酸菌属等的相对丰度显著高于样品F的(P<0.05)。试验结果表明,川中黑山羊瘤胃中相对丰度最高的菌门为拟杆菌门,相对丰度最高的菌属为普雷沃氏菌属,且两瘤胃样品中部分细菌相对丰度间的差异显著。

Illumina MiSeq测序平台测定蒙古羊瘤胃液相和固相菌群多样性

本研究旨在比较蒙古羊瘤胃液相和固相细菌菌群多样性。应用Illumina Miseq测序平台的16S r RNA基因扩增子技术对采集自5只蒙古羊的瘤胃液相和固相样品进行高通量测序,采用UPARSE-操作分类单元(OTU)法和非加权组平均(UPGMA)法分析试验结果。结果表明,共获得91 971条序列和15 321个OTU,平均每个样品有13 138条序列和2 189个OTU。液相与固相样品相比:门水平分类上存在显著性差异的优势菌群为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)(P<0.05),拟杆菌门在液相和固相样品中的比例分别为67%和45%;属水平分类上存在显著性差异的优势菌群为普氏菌属(Prevotella)和1种未鉴定(unknown)的属(P<0.05),液相样品优势菌群为普氏菌属,所占比例为53%,而固相样品优势菌群来自1种未鉴定的属,所占比例为32%;种水平分类上存在显著性差异的是栖瘤胃普雷沃菌(Prevotella ruminicola)(P<0.05),在液相和固相样品中所占的比例分别为41%和11%。与液相样品相比,固相样品的alpha多样性较好;主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCo A)显示来自同一动物个体的瘤胃液相和固相样品聚类在一起。结果提示,蒙古羊瘤胃液相和固相样品均具有丰富的细菌菌群;与液相样品相比,固相样品细菌的多样性更好。

扩增区域对鲊广椒细菌MiSeq测序的影响

在使用引物27F/338R、338F/806R和515F/907R分别对细菌16S rRNA基因的V_1～V_2区、V_3～V_4区和V_4～V_5区进行扩增的基础上,采用MiSeq高通量测序评价扩增区域对鲊广椒细菌多样性分析结果的影响。结果发现,扩增16S rRNA基因V_4～V_5区的非特异性序列所占比例显著偏低(P<0.05),而扩增V_1～V_2区样品细菌的Chao 1指数显著偏高(P<0.05)。虽然扩增16S rRNA基因的V_3～V_4区会导致Cyanobacteria(蓝细菌门)和Pediococcus(小球菌)相对含量显著偏高(P<0.05),但不同扩增区域扩增出的同一样品其微生物群落结构无显著差异(P>0.05)。在对鲊广椒细菌多样性进行解析时,建议选择引物515F/907R扩增16S rRNA基因的V_4～V_5区。

基于Miseq的好氧反硝化菌源水脱氮的种群演变

为了研究好氧反硝化菌源水脱氮过程中水体微生物群落的演变,利用Miseq高通量测序法对投菌和对照两系统水体样本的微生物信息进行统计,并对两组样品进行了优化序列统计,OTU分布统计和分类学分析的基础分析;以及细菌群落结构,PCA,Rank-Abundance,Hcluster,Specaccum和OTU分布的高级分析.结果显示,投加贫营养好氧反硝化菌的源水系统的氮素得到有效去除,脱氮效果明显;层次聚类和主成分分析显示两系统内的群落结构发生变化,投菌系统与对照系统主要表现为变形菌和拟杆菌门;细菌主要门类和水质参数的相关性分析得出,水质指标对两系统群落变化作用明显;与此同时,投菌系统中有关氮循环的细菌有上升的变化过程.Miseq高通量测序研究源水脱氮过程的微生物种群演变可行,为研究原位生物脱氮过程的水体微生物群落演变提供技术支撑.

基于Miseq高通量测序技术的辣椒酱核心细菌类群研究

在采用Miseq高通量测序技术对6个辣椒酱细菌微生物多样性进行解析的基础上,进一步使用电子舌对辣椒酱的滋味品质进行评价,探讨核心细菌类群对辣椒酱滋味品质的影响。结果表明,芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)是湖北当阳地区辣椒酱中的优势细菌微生物,其相对含量分别为37.62%和20.66%。在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上发现14个核心OTU,其中分别有5个和3个OTU隶属于芽孢杆菌(Bacillus)和葡萄球菌s(Staphylococcu)。酸味是辣椒酱样品间差异最大的滋味指标,微生物构成对辣椒酱滋味品质的形成具有较大的影响。

基于Miseq高通量测序技术对细菌型豆豉细菌类群的评价

采用Miseq高通量测序技术对6个细菌型豆豉细菌多样性进行了评价,同时使用电子舌对不同样品各滋味指标的相对强度进行了测定,进而探讨了细菌类群对产品滋味品质的影响。结果表明,Bacillus(芽孢杆菌)是细菌型豆豉中的优势细菌,其相对含量为95.26%。在分类操作单元(Operational taxonomic units,OTU)水平上,发现5个核心OTU相对含量大于0.1%,其中4个隶属于Bacillus,OTU2133(隶属于芽孢杆菌)的平均相对含量为91.91%。酸味是豆豉间差异最大的滋味指标,且Bacillus、Staphylococcus(葡萄球菌)和Lactobacillus(乳酸杆菌)与豆豉酸味的形成均呈正相关。由此可见,鲊广椒中细菌微生物主要是由Bacillus组成,且Lactobacillus和Staphylococcus对豆豉滋味的形成具有影响。

基于变性梯度凝胶电泳和MiSeq高通量测序技术分析恩施地区腊肉的细菌多样性

以采集自湖北省恩施地区的5个腊肉样品为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase?chain?reaction-denatured?gradient?gel?electrophoresis,PCR-DGGE)与MiSeq高通量测序技术相结合的方法对其中所含微生物的多样性进行解析。PCR-DGGE结果表明,腊肉样品中的细菌主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas);MiSeq高通量测序结果表明,腊肉中的细菌门主要为硬壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),其平均相对含量分别为54.05%和44.28%,细菌属主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、环丝菌属(Brochothrix)、科贝特氏菌属(Cobetia)和不动细菌属(Acinetobacter),其平均相对含量分别为40.18%、24.02%、9.37%、8.53%、4.71%和2.31%;在分类操作单元(operational taxonomic units,OTU)水平上,发现252个核心OTU,累计平均相对含量高达74.22%。由此可见,PCR-DGGE和MiSeq高通量测序的结果综合分析得出恩施地区腊肉中的细菌主要为葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。

应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析活性银离子处理饮用水微生物多样性

为观察作为载人航天消毒剂的银离子消毒水所呈现的微生物多样性,采用Illumina MISeq高通量测序技术,对添加不同浓度的活性银离子的市售桶装水和对照水样进行了分析,分组为CK(对照)、L(0.1 mg/L)、M(0.3 mg/L)和H(0.5 mg/L)组,每隔30 d定期取样,同时以GB 4789-2010进行了菌落总数和大肠菌群数测定和16S r DNA V3-V4区高通量测序,以及生物信息学分析,包括群落结构、多样性、主成分及物种丰度分析。结果表明:CK组30 d菌落计数即达557.3±58.2,活性银离子有较为显著的抑菌效果(L组60 d后1.7±0.6、H组90 d后1.7±0.6);高通量测序数据显示,其群落结构比例最大的是变形菌门,其次是厚壁菌门,然后是放线菌门;beta多样性和主成分分析结果显示鞘氨醇单胞菌属和乳球菌属丰度较高;活性银离子对饮用水有显著的抑菌作用,且可减少细菌群落。

基于Miseq高通量测序技术的古襄阳酒窖泥细菌多样性评价

使用Miseq高通量测序技术对4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品的细菌多样性进行了评价,同时通过选择性培养分离出窖泥中的优势乳酸菌,再利用16S r DNA序列分析方法,对其进行初步鉴定。结果表明,乳酸杆菌是古襄阳酒窖池中的优势细菌,其相对含量高达92.02%。在分类操作单元(OTU)水平上,发现8个核心OTU相对含量>1.0%,其中7个隶属于乳酸杆菌属(Lactobacillus)。4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品中共分离到12株菌株,初步鉴定其全部为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

应用MiSeq测序分析自然发酵豆酱酱块中微生物的多样性

为探究传统自然发酵豆酱酱块中微生物多样性,本文首次应用Miseq测序对采自沈阳胡台的6家传统自然发酵成熟酱块样品进行微生物测序分析。结果表明,在门水平上,细菌的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes),真菌为子囊菌门(Ascomycota);在属水平上,主要细菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc),主要真菌为青霉菌属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)。主成分分析(Principal component analysis,PCA)结果显示,同一地区不同农家制作的酱块,绝大多数样品的微生物细菌菌群之间都存在紧密联系。

基于Illumina MiSeq技术比较二种多脂鱼在腌干过程中的菌相变化

通过比较研究多脂红肉鱼(蓝圆鲹)和白肉鱼(带鱼)腌干加工中菌相的变化规律,以探讨加工过程对菌相的影响并寻找具有抗氧化作用的优势菌。在腌干加工过程中采用Illumina平台的MiSeq技术比较分析了两种多脂鱼的菌相变化情况。结果显示,两种鱼的菌相主要分布在拟杆菌门、变形菌门;在科水平上,初始原料的蓝圆鲹和带鱼分别含7个和15个科的细菌,带鱼包括了蓝圆鲹的所有菌群,肠杆菌科作为共同的优势菌,在蓝圆鲹和带鱼中分别占47%和26%。从腌制开始,两种鱼的菌群数都大量减少,弧菌和芽孢杆菌科作为共同优势菌,前者平均占蓝圆鲹和带鱼的40.3%和42.2%,后者则平均占16.7%和13.3%。原料中,蓝圆鲹和带鱼都包含了肠杆菌科、假单胞菌、弧菌科和希瓦氏菌科这4种腐败菌,加工阶段,两种鱼的优势腐败菌都为弧菌科。乳酸菌包括链球菌科和乳杆菌科,仅出现在带鱼中。研究表明,在腌干加工中,带鱼的细菌减少程度大于蓝圆鲹,总体上均呈现下降趋势,两种鱼含共同的菌群和优势菌,却表现出明显的差异。腌干后两种鱼的腐败菌大大减少,说明腌干加工有利于降低鱼类腐败的可能性。可选择带鱼作乳酸菌的分离以进行后续的抗氧化研究。

利用Illumina MiSeq高通量测序技术分析原料乳的菌群分布

为测定原料乳中的菌群分布情况,应用Illumina MiSeq高通量测序方法,主要对14个奶牛场的原料乳进行采集,通过DNA测序确定菌群的多样性及致病菌的分布情况,进行操作分类单元聚类分析、Alpha多样性分析、物种分类分析3方面的测定。结果表明不同牧场的菌群存在多样性,位于前列的分别是肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、乳球菌属(Lactococcus),同时表明,个别牛场原料乳中有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺菌(Shigella)的存在。

基于Miseq法纳豆冻干粉对小鼠肠道菌群影响的研究

抗生素近年来被滥用,它抑制或杀死微生物使得机体菌群失调。因此找出一种抗生素的安全有效替代物非常有必要,而益生菌是一种有效的替代物。本研究以纳豆冻干粉为原料,正常小鼠和肠道菌群失衡小鼠为动物试验模型,采用体内灌胃试验和Miseq方法研究纳豆冻干粉对小鼠肠道菌群的影响并进行生物信息分析。分析多样本间的肠道菌群多样性和单样本属水平上的分类情况;分析纳豆芽孢杆菌及益生菌、致病菌的菌数变化情况。预期的研究结果为揭示纳豆芽孢杆菌的肠道菌群调节机理提供科学依据,对人类健康和传统发酵食品微生物的开发具有十分重要的意义。