错配修复蛋白和微卫星不稳定在结直肠癌中检测中的对比分析

目的 比较PCR-毛细管电泳法与IHC两种检测方法对微卫星状态判断的差异性与一致性,以期寻找到更适合临床广泛开展筛查的方法。方法 326例结直肠癌手术切除标本,IHC方法检测癌组织4种错配修复蛋白MMR蛋白的表达。选取其中68例标本用PCR毛细管电泳法检测6个微卫星位点。最后对比这68例患者两种检测结果的敏感性、特异性及一致性。结果 326例结直肠癌手术样本中,有29例IHC结果为dMMR,剩余297例为pMMR。将这29例dMMR标本全部进行PCR毛细管电泳法检测,另挑选297例pMMR中的39例标本进行PCR-毛细管电泳法检测,共计68例。68例标本检测结果显示高度微卫星不稳定(MSI-H)23例,低度微卫星不稳定(MSI-L)5例,微卫星稳定(MSS)40例。统计分析发现,IHC法检测的敏感度和特异性分别为96%和95%,PCR-毛细管电泳法检测的敏感度和特异性分别为93.1%和97.4%,两种方法的一致率达到95.6%。结论 IHC检测MMR蛋白和PCR-毛细管电泳法检测微卫星位点具有较高的一致性,由于IHC方法经济、便捷的特点,更适合在临床推广,因此可以作为临床初筛结直肠癌微卫星不稳定的一种方法。当存在任一MMR蛋白缺失或对有疑问的标本,可进行进一步的PCR-毛细管电泳检测。

PCR及其衍生技术在基因突变检测中的应用

许多人类遗传性疾病及某些抗艾滋病药物的抗性乃至细菌对某些抗生素的抗药性通常源于基因突变。本文对近年来在基因突变检测中应用日益广泛的各种PCR衍生技术作一综述;重点介绍了错配PCR技术,以及我们实验室近期报道的一种快速检测喹诺酮类药物耐药大肠杆菌的错配PCR方案。

用等位基因特异PCR检测普通小麦(Triticum aestivum L.)的单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系(RIL)的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料,研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列,在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3′端,设计等位基因特异引物及其互补引物,对SNP进行分型,同时研究了特异引物3′端碱基错配对等位基因特异PCR的影响,优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3′端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大;在等位基因特异PCR中,Mg2+、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3′端加上合适的错配碱基,并且优化其PCR反应体系,用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。

散发性结直肠癌组织病理学特征及微卫星不稳定状态分析400例

目的:探讨高度微卫星不稳定性(high level of micro satellite instability,MSI-H)结直肠癌临床病理学特征.应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中DNA错配修复蛋白缺失表达,判断肿瘤MSI状态,建立筛选与遗传相关结直肠癌常规诊断流程.方法:分析临床特点,光镜下观察肿瘤组织形态学特征,免疫组织化学SP法分析肿瘤DNA错配修复蛋白表达缺失情况,判断肿瘤MSI状态,荧光定量PCR法进一步证实肿瘤MSI状态.结果:400例散发性结直肠癌,以男性左半结肠多见,免疫组织化学方法检测到MSI-H18例,MSI-L98例,MSS284例,MSI-H肿瘤以老年女性左半结肠多见.MSI-H结直肠癌形态学多见绒毛乳头状结构,高、低分化,黏液腺癌、印戒细胞癌或伴有黏液分化,肿瘤上皮内淋巴细胞浸润、肿瘤间质内见Crohn样淋巴细胞反应及瘤周淋巴浆细胞浸润明显,多数缺乏坏死.荧光定量PCR法进一步对18例MSI-H肿瘤进行分析,证实MSI-H7例,MSI-L1例,MSS6例,同时发现4例肿瘤存在等位基因杂合性缺失.结论:散发性MSI-H结直肠癌与病理形态学具有明显相关性,与患者年龄、性别、部位无显著相关.结合形态学及免疫组织化学检测错配修复蛋白可作为判断MSI-H肿瘤的常规筛查方法,对患者进行临床监控、个体化治疗及筛选与遗传相关结直肠癌具有重要临床意义,但对MSI-H肿瘤最终确诊及是否与遗传相关仍需进行分子生物学方法检测进一步证实.

急性胰腺炎患者Toll样受体4基因多态性分析研究

目的研究Toll样受体4(TLR4)突变与急性胰腺炎(AP)发展及预后的相关性。方法采用错配聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析方法在AP和健康志愿者人群中检测TLR4(896A>G)的突变频率。结果①所有TLR4的突变均为杂合子;②AP组TLR4(-/+)基因型频率在轻症AP组和重症AP中呈轻度升高,与健康志愿者组比较差异无统计学意义(P>0.05);③在AP组中,TLR4(-/+)基因型频率呈波浪形升高趋势,并在胰腺组织坏死合并感染组达到峰值;与健康志愿者组相比,胰腺组织坏死合并感染组TLR4(-/+)等位基因型频率差异有统计学意义(P<0.05);④与无胰腺组织坏死组相比,胰腺组织坏死组TLR4(-/+)基因型频率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TLR4错义突变(TLR4 896A>G)在AP发生发展中具有重要的作用,TLR4的基因突变可以损害机体的防御反应。

片段长度差异等位基因特异性PCR—一种改良的SNP分型新方法

目的建立一种基于等位基因特异性PCR原理的改良SNP分型新方法:片段长度差异等位基因特异性PCR,并考察特异性引物的3'端第3位、第4位碱基错配对特异性延伸的影响。方法以SNP位点rs759117和rs760887为例,设计两条长度不同、3'末端分别与SNP两个等位基因碱基配对的上游引物,同时在两个等位基因特异性引物3'端第3或第4位碱基引入错配以增加特异性,下游为公用引物。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显带后确定样本的基因型。结果不同SNP纯合子为长度不同的单一谱带,杂合子则为两条带,其结果与直接测序完全一致。两条特异性上游引物3'端第3或第4位碱基引入错配后非特异性延伸显著减少,且对PCR反应条件的严格性要求明显降低。结论片段长度差异等位基因特异性PCR是一种简单快速而有效的SNP分型新方法;两条特异性引物3'端第3。

食管癌和贲门癌组织中错配修复基因表达的研究

目的 研究错配修复基因 (MMR)表达与食管癌和贲门癌癌变的关系和甲基苄基亚硝胺 (NMBzA)对其影响的研究。方法 采用多重逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)。结果 31例食管癌hMSH2基因表达明显降低占 2 2 .6 % ;hMLH1基因表达明显降低占 6 .45 % ;未发现hPMS2 ,GTBP和hPMS1基因表达降低。 1 1例食管癌旁组织分析 :hMSH2 ,hPMS2 ,GTBP ,hMLH1基因表达明显降低占 9.0 9% ;未发现hPMS1基因表达明显降低。 1 2例贲门癌组织分析 :hMSH2基因表达明显降低占 41 .7% ;GTBP ,hMLH1 ,hPMS1基因表达明显降低占 8.3 % ;未发现hPMS2基因表达明显降低。 8例贲门癌旁组织分析 :3例hMSH2基因表达明显降低 ;1例hPMS2基因表达明显降低 ;3例hMLH1基因表达明显降低 ;未发现GTBP ,hPMS1基因表达明显降低。对NMBzA致癌物诱发的人胎儿食管上皮癌细胞株分析发现 :hMLH1和hPMS1基因低表达 ;hMSH2 ,hPMS2 ,GTBP基因不表达。结论 食管癌和贲门癌癌变可能与错配修复基因失活有关 ;甲基苄基亚硝胺能引起错配修复基因表达异常。

四引物PCR扩增反应的单管SNP快速测定法

建立一种在单管中进行单核苷酸多型性 (SNP)快速测定的高效廉价方法 .以人ABCA1基因中的I82 3M为研究对象 ,设计 4种引物进行PCR扩增 ,其中两种引物用于扩增一段含有SNP位点的DNA片段 ,另两种引物为SNP位点特异性引物 ,4种引物在单管中同时进行PCR扩增反应 ,根据延伸产物的长度确定SNP的类型 .为提高SNP测定的特异性 ,在特异性引物的 3′端倒数第 3个碱基引入了一个人为错配碱基 ,使引物的错误延伸率显著降低 ,大大提高了SNP分析的准确性 .实验结果表明 ,所建立的方法简单 ,操作简便 ,可在单管中完成SNP的测定反应 .

PCR-CTPP:一种基于错配技术的SNP分型方法的改良

为探讨两对交叉引物PCR(PCR-CTPP)技术的原理并提高SNP分型的准确性,以人类MTHFR基因1298位点突变为例,通过设计合理的引物、优化引物终浓度及复性温度等重建PCR-CTPP检测系统,对比常规PCR-CTPP和改良的PCR-CTPP检测系统的可靠性。结果表明,改良的PCR-CTPP检测系统更加准确,支持了常规方法存在理论缺陷的观点;批量鉴定结果进一步验证了改良方法的可靠性。该技术有望在医学和分子生物学等领域广泛应用。

错配PCR方法快速检测耐FQs沙门氏菌基因突变的初步研究

根据耐药沙门氏菌基因突变位点碱基变化情况,设计合适的引物进行错配PCR,鉴别突变位点,使其结果与测序结果相吻合,以建立错配PCR方法快速检测耐氟喹诺酮类药物沙门氏菌基因突变,判断菌株是否耐药。错配PCR检测方法条件优化成熟之后,对经过测序的菌株进行耐药突变位点的快速检测,检测结果与测序结果符合率高达96%。

上海禽源弯曲菌对大环内酯类药物的耐药性及其机制研究

为研究上海地区禽源弯曲菌对大环内酯类药物耐药状况及其耐药机制,本研究采用微量琼脂稀释法测定了209株弯曲菌(空肠弯曲菌84株,结肠弯曲菌125株)对大环内酯类药物(红霉素和阿奇霉素)的最小抑菌浓度,采用错配PCR方法检测大环内酯类耐药弯曲菌的23S rRNA基因突变情况。药物敏感性测定结果表明,空肠弯曲菌对红霉素和阿奇霉素的耐药率分别为5.95%(5/84)和2.38%(2/84),结肠弯曲菌对红霉素和阿奇霉素的耐药率分别为84%(105/125)和80.8%(101/125)。错配PCR结果显示,2株耐药空肠弯曲菌和76株耐药结肠弯曲菌均存在23S rRNA基因的A2075G突变,但未检测到A2074C突变。还有25株耐药结肠弯曲菌不含有A2075G和A2074C突变,对这些菌株的完整23S rRNA基因进行测序也未发现耐药相关突变。本研究结果显示上海市的禽源结肠弯曲菌对大环内酯类的耐药率远高于空肠弯曲菌,并且表明23S rRNA基因的A2075G突变是上海市禽源弯曲菌对大环内酯类药物耐药的主要机制。

错配PCR对牛X染色体相关基因杂合子的检测

利用DNA测序技术,在荷斯坦奶牛胎儿中找到X染色体基因GLRA2 3’端的杂合位点(C/T),设计错配引物在该位点对胎儿及其父本、母本基因组进行PCR扩增,建立起GLRA2基因的错配PCR技术,该技术可以快速在群体基因组中检测这一杂合位点.

大口黑鲈内含子1上SNP G208A的CRS-PCR检测方法

创造限制酶切位点PCR法是应用引物错配技术结合单核苷酸多态性(SNP)而配合成一个酶切位点,使SNP可用于PCR-RFLP分析的一种方法。应用CRS-PCR技术检测了大口黑鲈(Micropterus salmoides)IGF-I基因内含子1上SNPG 208A的多态性,并详述了CRS-PCR错配引物的设计方法,CRS-PCR引物设计和应用的注意事项,以促进CRS-PCR单核苷酸多态检测方法在水产动物研究领域的应用。

错配修复基因的异常表达与淮安食管癌发病的关系

背景与目的:研究错配修复相关基因hMLH1和hMSH2的mRNA表达水平与食管癌发病的关系。材料与方法:收集112例淮安地区食管癌新发病例的食管癌组织及远端癌旁组织,采用实时荧光定量PCR方法定量分析食管癌组织与癌旁组织中hMLH1和hMSH2基因的表达水平,应用t检验和logistic回归分析评价基因的表达水平与食管癌的关系。结果:hMSH1基因的mRNA表达水平在食管癌与癌旁组织间的差异不明显,而hMSH2基因的mRNA表达水平在食管癌组织显著低于癌旁组织(下调了51.2),条件logistic回归分析表明hMSH2的表达下调与食管组织癌变有统计学关联(OR=1.311,95CI:1.075～1.599)。结论:错配修复相关基因hMSH2的表达水平下降提示食管癌组织错配修复能力异常,可能是淮安地区食管癌发病的危险因素之一。

镉胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响

采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术研究了Cd胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗错配修复和增殖细胞核抗原基因表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cd胁迫敏感的生物标记物。结果表明:不同浓度(0.25、0.5、1.0 mg.L-1)Cd处理对拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜质量影响不大;Cd浓度为0.25 mg.L-1时,地上部分可溶性蛋白质含量明显升高(P<0.05),Cd浓度为0.5和1.0 mg.L-1时,可溶性蛋白质含量明显降低(P<0.05);叶绿素含量随着Cd浓度的增加而微弱增加(P>0.05)。Cd浓度为0.25 mg.L-1时,以18S rRNA为内参照,PCNA1、PCNA2、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7 6个基因均出现了诱导表达,当Cd浓度增加到1.0 mg.L-1时,除了MSH6持续表达诱导及MSH3基因与对照相比表达抑制外,其他基因的表达依然出现诱导,但都低于0.5 mg.L-1Cd处理下的基因表达水平。以上结果表明,基因表达的改变可作为检测Cd污染对植物遗传毒性效应潜在有用的生物标记物。

PCR-SSCP在遗传性非息肉病性大肠癌错配修复基因种系突变检测中应用

目的 :探讨 PCR- SSCP在遗传性非息肉病性大肠癌错配修复基因种系突变检测中的应用。方法 :抽提 8例 HNPCC患者外周血基因组 DNA,PCR法扩增 h ML H114外显子 ,行 EB染色的 SSCP检测。结果 :8例患者 14外显子两条单链清晰可见 ,对 1例进行了自动测序 ,符合 Gene Bank公布的 h ML H114外显子序列。结论 :EB染色 PCR- SSCP是一种敏感度较高、简单经济的方法 。

植物基因组编辑检测方法

以CRISPR/Cas9技术为代表的基因组编辑在生物领域的革命性应用使得生命科学研究迈入新篇章。该技术以其灵活性、易用性且扩展性强等优势,大大加快了基因工程研究,也加速了植物分子育种的步伐。但是,遗传转化过程中产生大量潜在的基因编辑植株,使得早期高通量快速筛选和检测目标编辑植株面临很大挑战。本文综述了近年来植物基因组编辑检测的各种方法,比较了其优缺点和适用范围;同时,还对近几年植物基因组编辑检测方法的发展趋势进行了深入分析和展望,以期对基因组编辑技术在植物中的应用提供参考。

PCR-SSCP银染法在检测错配修复基因突变中的应用

目的建立稳定、有效地检测错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因突变的方法。方法对30例肠癌及癌旁正常组织标本分别提取DNA,设计错配修复基因hMSH1引物,应用聚合酶链式反应进行PCR扩增,10%聚丙稀酰胺凝胶电泳PCR产物,银染等技术检测分析错配修复基因hMSH1突变;hMSH1抗体为一抗,免疫组化法检测30例肠癌及例癌旁正常组织石蜡切片中hMSH1蛋白的表达。结果30例肠癌组织中发生错配修复基因hMSH1突变4例(发生率13.3%),10例癌旁正常组织中无一例发生错配修复基因hMSH1突变;免疫组化检测到30例肠癌组织中有6例hMSH1蛋白表达阴性,其中hMSH1基因突变的组织hMSH1蛋白均未表达,正常组织中hMSH1蛋白表达正常。结论PCR-SSCP银染法是检测错配修复基因突变的简捷、稳定、有效的方法之一。可成为早期诊断肿瘤发生的分子手段。在肿瘤的早期治疗中具有重要作用。

广州汉族配偶人类血小板抗原基因分型的调查

目的调查配偶之间人类血小板抗原(HPA)的不配合率并评估其在新生儿同种免疫性血小板减少症(NAIT)中的作用。方法采用SSP法对200对广州汉族配偶进行了HPA-1～-16基因分型。结果配偶双方HPA-1～-6及HPA-15均在同一HPA位点具有不同基因型,HPA-7～-14及HPA-16均为a/a纯合子。得到HPA-1～-16的等位基因频率,HPA-15、HPA-3、HPA-2、HPA-6、HPA-5、HPA-1和HPA-4的不配合率为别为37.42%、37.02%、8.02%、3.84%、2.44%、0.75%和0.24%,其余HPA位点的不配合率为0。结论 HPA-5可能是广州汉族人群NAIT最重要的一个HPA系统,HPA-15、HPA-3、HPA-2、HPA-6和HPA-4也分别具有其免疫学意义,这为HPA的抗体检测以及NAIT的诊断治疗提供了实验依据。

Cu胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响

采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以18SrRNA为内参基因,研究了Cu胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗错配修复相关基因(MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7)表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cu胁迫敏感的生物标记物。结果表明,Cu处理10d后,对拟南芥种子发芽率、地上部鲜重及叶绿素含量的影响不大;根的长度明显受到抑制;拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质含量随着Cu浓度增加明显降低;5个错配修复相关基因的表达均受到不同程度的抑制,Cu浓度与拟南芥幼苗上述指标之间存在明显的剂量-效应关系。以上结果表明,地上部可溶性蛋白含量变化与上述错配修复相关基因表达量的改变趋势一致,且均对Cu胁迫较敏感,可以作为检测Cu污染对植物遗传毒性效应的生物标记物。