从线粒体膜稳定作用探讨线粒体K(MITO-KATP)通道开放剂改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制

目的从线粒体膜稳定作用探讨线粒体K+ATP(MITO-KATP)通道开放剂尼可地尔(Nicorandil,Nic)改善老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制。方法选取60只健康雄性SD老年大鼠(18~20个月),体重400~600g,随机分为3组:假手术(Sham)组、模型(Model)组和尼可地尔(Nic)组,每组10只。建立老年冠心病大鼠心肌缺血再灌注(MI/R)模型,尼可地尔(Nic)组在再灌注之前,股静脉注射尼可地尔5mg/kg,假手术组和模型组注射等量的生理盐水。3组大鼠在术后24h进行腹主动脉取血,分别检测大鼠血清中,肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的水平变化;采用流式细胞仪测定大鼠心肌细胞线粒体膜电位的变化情况;采用WesternBlot法测定心肌细胞线粒体中p-Cx43蛋白变化情况,心肌组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况的变化。结果与Sham组相比,模型组大鼠血清中CK-MB和LDH的含量增加(P<0.05),说明心肌缺血再灌注会导致心肌细胞损伤;与模型组相比,尼可地尔组大鼠血清中CK-MB和LDH的含量下降(P<0.05),说明尼可地尔有抗心肌缺血的作用。采用阳离子绿色荧光染料罗丹明123对线粒体的膜电位进行检测,与Sham组相比,模型组大鼠心肌线粒体膜电位降低(P<0.05),而尼可地尔组大鼠心肌线粒体膜电位高于模型组(P<0.05),说明心肌细胞凋亡时会导致线粒体膜电位降低以及功能变化,而线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔可以缓解线粒体的损伤情况。WesternBlot结果表明,与Sham组相比,模型组大鼠心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达下调,而尼可地尔组大鼠心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达高于模型组,说明尼可地尔能够上调心肌线粒体p-Cx43的蛋白表达,维持线粒体的稳定性。与Sham组相比,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调;而尼可地尔组大鼠心肌组织中Bcl-2的蛋白表达上调,Bax蛋白表达下调,说明线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔可有效抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。结论线粒体K+ATP通道开放剂尼可地尔对心肌缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能是通过降低大鼠血清中CK-MB和LDH的含量,维持线粒体膜稳定性,抑制心肌细胞的凋亡。

Mito-KATP对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响及作用机制

目的探讨线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)开放影响缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)凋亡的作用机制。方法培养大鼠心肌微血管内皮细胞,随机分为四组:对照组(N组)、模型组(H/R组)、开放剂组(DZ组)、阻断剂组(5-HD组)。DZ组加入100μmol/L二氮嗪预处理2 h,5-HD组在加入100μmol/L二氮嗪前,先用100μmol/L 5-羟葵酸预处理2 h,然后上述两组和H/R组同样进行缺氧2 h复氧2 h。Hoechst染色方法观察凋亡细胞形态,Annexin V-FITC/PI双标记法测定各组细胞凋亡率、RT-PCR法检测各组NF-κB、FKN和p53 mRNA转录水平。结果与N组比较,H/R组可见大量细胞坏死、脱落,细胞凋亡率升高(P<0.01),NF-κB、FKN和p53 mRNA表达上调(P<0.01);与H/R组比较,DZ组可见部分细胞坏死脱落,细胞凋亡率降低(P<0.01),NF-κB、FKN和p53 mRNA表达下调(P<0.01);5-HD组与H/R组比较无显著差异。结论 mito-KATP开放可抑制缺氧复氧所致MMECs凋亡,其机制可能与抑制NF-κB、FKN及p53 mRNA表达有关。

PI3K/Akt在线粒体ATP敏感性钾通道开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞FKN表达中的作用

目的观察PI3K/Akt信号在线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)开放抑制缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)fractalkine(FKN)表达中的作用。方法培养SD大鼠离体MMECs,建立缺氧复氧损伤模型24皿,随机分为4组(n=6):正常对照组(N组)、缺氧/复氧组(H/R组)、二氮嗪预处理+缺氧/复氧组(DZ组)、LY294002+二氮嗪预处理+缺氧/复氧组(LY294002+DZ组)。DZ组加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,LY294002+DZ组在加入100μmol/L LY294002预处理2h后再加入100μmol/L二氮嗪预处理2h,然后和缺氧复氧组同样进行缺氧2h、复氧2h。Hoechst染色观察凋亡细胞显微结构,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力,RT-PCR检测Akt和FKNmRNA水平,Western blotting检测Akt蛋白水平。结果与N组比较,H/R组细胞增殖率显著降低(P<0.01)、凋亡率显著升高(P<0.01),FKN mRNA和FKN蛋白表达显著增加(P<0.01)、Akt mRNA和Akt蛋白升高(P<0.05)。与H/R组比较,DZ组细胞增殖率显著升高(P<0.01)、凋亡率显著降低(P<0.01),AktmRNA和蛋白显著升高(P<0.01和P<0.05),FKN mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01)。与DZ组比较,LY294002+DZ组Akt mRNA和蛋白显著降低(P<0.01)、FKN mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论mito-KATP开放通过PI3K/Akt信号调节下游FKN mRNA的转录及表达,促使细胞增殖,抑制细胞凋亡,实现对缺氧复氧MMECs损伤的保护。

二氮嗪预处理对培养H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨线粒体KATP(Mito-KATP)通道特异性开放剂二氮嗪预处理在H9C2心肌细胞缺氧、复氧损伤中的作用及其机制。方法将培养的H9C2心肌细胞随机分为5组,即(Ⅰ)对照组;(Ⅱ)缺氧/复氧组;(Ⅲ)二氮嗪(DZ)预处理组;(Ⅳ)二氮嗪加ROS清除剂2-巯基丙酰氨基乙酸(MPG)预处理加缺氧/复氧组;(Ⅴ)二氮嗪加PKC的特异性抑制剂氯化白屈菜赤碱(CH)预处理加缺氧/复氧组。对照组常规培养;缺氧/复氧组缺氧培养100min,复氧30min;其余各组则加入相应的药物预处理10min,DZ、MPG和CH的终浓度分别为200、400mmol/L和2mmol/L,更换无血清培养基培养20min,然后再缺氧100min,复氧30min。采用Hoechst33258染色、JC-1荧光标记和Westernblotting等方法分别检测H9C2心肌细胞的凋亡率、线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放量。结果二氮嗪预处理能减少缺氧/复氧损伤后H9C2心肌细胞的凋亡率(P<0.01);阻止线粒体膜电位的下降(P<0.01);减少线粒体释放细胞色素C(P<0.01);预处理过程中加入MPG、CH在一定程度上可抑制二氮嗪预处理的心肌保护效应。结论缺氧/复氧损伤可通过降低H9C2心肌细胞线粒体膜电位,引发线粒体释放细胞色素C,从而诱导心肌细胞的凋亡。开放Mito-KATP通道能减轻H9C2心肌细胞的缺氧/复氧损伤,其机制可能与开放Mito-KATP通道、释放信号分子ROS和激活PKC有关。

线粒体ATP敏感性钾通道在缺血预适应中对心肌缺血-再灌注损伤的保护效应

目的探讨缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)对心肌缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)的保护作用以及线粒体ATP敏感性钾通道(Mito KATP)在IPC效应中的作用。方法建立大鼠在体IPC和IRI模型,设立对照组(假手术组)、IRI组、IPC+IRI组、二氮嗪+IRI组和5-羟葵酸(5-HD)+IPC+IRI组,每组10只。观察各组心肌细胞凋亡指数和细胞色素C表达,超氧化物酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及髓过氧化物酶(MPO)活性。结果与对照组相比较,IRI组和5-羟葵酸(5-HD)+IPC+IRI组,心肌细胞中SOD活性显著降低,MDA含量和MPO活性明显增高(P<0.01),心肌细胞凋亡指数及细胞色素C表达显著增多(P<0.01),而IPC+IRI组和二氮嗪+IRI组,SOD活性、MDA含量和MPO活性差异均无统计学意义(P>0.05);与IRI组比较,IPC+IRI组及二氮嗪+IRI组以上指标差异均有统计学意义(P<0.01),而5-羟葵酸+IPC+IRI组的各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IPC可明显减轻大鼠心肌的IRI,Mito MATP通道开放参与了IPC对心肌IRI的保护作用。

PI3K/Akt信号途径在二氮嗪抑制缺氧-复氧大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡中的意义

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt(PI3K/Akt)信号途径在二氮嗪抑制缺氧-复氧(H-R)大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)凋亡中的意义。方法将培养的SD大鼠MMECs随机分为正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(H-R组,缺氧2h复氧2h)、二氮嗪+缺氧-复氧组(DZ组,二氮嗪100μmol/L预处理2h+缺氧2h复氧2h)、PI3K特异性阻滞剂LY294002+二氮嗪+缺氧-复氧组(LY294002组,LY294002 100μmol/L预处理2h+二氮嗪100μmol/L预处理2h+缺氧2h复氧2h)。Hoechst染色观察凋亡细胞结构,Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot分别检测Akt的mRNA和蛋白表达水平。结果与C组比较,H-R组细胞凋亡率升高,Akt mRNA和蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01);与H-R组比较,DZ组细胞凋亡率降低,AktmRNA和蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01);与DZ组比较,LY294002组细胞凋亡率升高,AktmRNA和蛋白表达减少(P<0.01)。结论 H-R损伤引起MMECs凋亡。线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(mito-KATP)开放后通过PI3K/Akt信号途径能部分抑制该作用。

缺氧-复氧大鼠心肌微血管内皮细胞NF-κB信号通路中二氮嗪对FKN表达的影响

目的观察缺氧-复氧(H-R)大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)NF-κB信号通路中二氮嗪对fractalkine(FKN)表达的作用。方法将培养的大鼠MMECs随机分为正常对照组(C组)、缺氧-复氧组(H-R组,缺氧2h+复氧2h)、二氮嗪+缺氧-复氧组(DZ组,二氮嗪100μmol/L预处理2h+缺氧2h+复氧2h)、NF-κB特异性阻断剂吡咯烷二硫基甲酸盐+二氮嗪+缺氧-复氧组(PDTC组,PDTC 100μmol/L预处理2h+二氮嗪100μmol/L预处理2h+缺氧2h+复氧2h)。Annexin-V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,MTT法测定细胞活力,RT-PCR法检测FKN mRNA水平。结果与C组比较,H-R组细胞凋亡率升高,增殖率降低,FKN mRNA表达增强(P<0.01);与H-R组比较,DZ组细胞凋亡率降低,增殖率升高,FKN mRNA表达降低(P<0.01);与DZ组比较,PDTC组细胞凋亡率升高,增殖率降低,FKN mRNA表达增强(P<0.01)。结论线粒体ATP敏感性钾通道开放通过NF-κB信号抑制MMECs的H-R损伤和FKN表达。

尼可地尔在急性前壁心肌梗死患者中的药物后适应作用

目的:探讨尼可地尔是否能通过模拟缺血后适应效应来减少急性前壁ST段抬高心肌梗死患者的心肌梗死面积。方法:急性前壁心肌梗死的患者随机分为两组,尼可地尔组(NIC组,21例)及消心痛组(ISDN组,22例)。NIC组患者在行PCI术前服用10mg尼可地尔,而ISDN组服用10mg硝酸异山梨酯。2组患者均在PCI前及PCI后8、16、24、48、72h测定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)浓度,术后7d行ECT心肌灌注显像。结果:尼可地尔能显著减少心肌梗死后的CK-MB峰值[NIC组(171.6±105.7)U/L,ISDN组(246.4±108.4)U/L,P<0.05],并能减少CK-MB曲线下面积[NIC组(4 309±2 575),ISDN组(5 854±2 352),P<0.05],改善ECT心肌灌注缺损面积占左室的百分比[NIC组(30.38±11.83)%,ISDN组(38.64±14.59)%,P<0.05],且NIC组ECT心肌灌注缺损评分优于ISDN组[NIC组(25.19±11.96),ISDN组(33.27±14.03),P<0.05]。结论:尼可地尔可以通过激活心肌细胞线粒体K-ATP通道,模拟药物后适应效应,从而减少心肌梗死面积。