MAD2 RNA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响

目的构建MAD2(有丝分裂阻滞缺陷蛋白2)特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制MAD2基因表达对胃癌细胞生长和细胞周期的影响。方法构建MAD2siRNA真核表达载体,脂质体法将pSilencer3.1空载体和pSilencer3.1/MAD2-siRNA1和pSilencer3.1/MAD2-siRNA2真核表达载体分别导入人胃癌细胞系SGC7901。稳定转染后Westernblot和RT-PCR检测胃癌细胞内MAD2蛋白及mRNA水平的表达情况,挑选出抑制效果最好的单个克隆。MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测纺锤体抑制剂长春新碱作用后,胃癌细胞MAD2-siRNA转染组和空载体组细胞周期的分布。结果成功构建MAD2siRNA真核表达载体,转染胃癌细胞SGC7901可使其MAD2蛋白及mRNA表达显著下调。MAD2表达降低的胃癌细胞生长速度明显增快(P<0.01),经长春新碱作用后不能被阻滞于有丝分裂期。结论小干扰RNA技术可以有效地特异性抑制胃癌细胞纺锤体检查点关键蛋白MAD2的表达。MAD2的抑制可使胃癌细胞SGC7901生长加速,增殖能力增强,同时减弱纺锤体抑制剂长春新碱阻滞细胞周期的作用。

mad2检测作为小细胞肺癌早期诊断潜在指标的临床研究

目的:探讨有丝分裂阻滞缺陷蛋白基因2(mitotic arrest deficient 2,mad2)联合抗纺锤体抗体(anti-nuclear mitotic spindle apparatus antibody,MSA)和抗着丝点抗体(anti-centromere antibody,ACA)检测对诊断小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)的临床意义。方法:对120例SCLC、110例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者和115例肺结节(pulmonary nodule,PN)患者用荧光定量PCR(qt-PCR)法检测mad2基因的表达,用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测MSA,ACA的表达。结果:mad2基因在SCLC,NSCLC患者中均有表达;和NSCLC相比,mad2在SCLC中表达量更高(P<0.05);mad2诊断SCLC的ROC曲线下面积为0.799,诊断价值中等;相关性分析中MSA、ACA与SCLC的OR值分别为6.94和5.60;一致性分析中mad2基因联合MSA诊断的Kappa值为0.49;mad2联合ACA诊断的Kappa值0.42;并联分析诊断的敏感性为83.31%,特异性为79.34%,约登指数为0.62;串联分析诊断的敏感性为65.32%,特异性为93.35%,约登指数为0.59。结论:mad2在SCLC组中的表达量高于NSCLC组及肺结节组,在SCLC发生发展中起到重要作用;mad2检测联合MSA及ACA有助于提高诊断敏感性及特异性,对SCLC的早期检测、临床诊断及潜在的治疗方法有一定的应用价值。

人剪切修复基因XPD肝癌对人HepG2细胞中Rb和MAD2表达的影响

目的:探讨人剪切修复基因着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染人肝癌HepG2细胞后视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma,Rb)和有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)表达的变化及对细胞增殖的影响。方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过LipofectamineTM2000转染HepG2细胞。实验分为4组,分别为无转染HepG2细胞组(空白对照组)、脂质体转染HepG2细胞组(脂质体组)、空载质粒pEGFP-N2转染细胞组(N2组)和重组质粒pEGFP-N2-XPD转染细胞组(XPD组)。分别用RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中XPD、Rb及MAD2 mRNA和蛋白的表达量,用MTT法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组的细胞凋亡情况及细胞周期。结果:与其它3组相比,XPD组XPD mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),Rb mRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.05),而MAD2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05)。XPD组细胞增殖活力显著降低,细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。XPD组细胞停滞在G1期,难以进入S期。结论:XPD可以抑制MAD2的表达和肝癌细胞的增殖,促进Rb的表达。

膀胱尿路上皮癌组织MAD2的表达及其意义

目的探讨膀胱尿路上皮癌(BUC)组织中有丝分裂阻滞缺陷蛋白(MAD2)的表达及其与膀胱癌病理分级、临床分期和预后的关系。方法采用免疫组化方法(SP法)检测47例BUC组织和12例正常膀胱黏膜组织中MDA2的表达,并分析MDA2表达与BUC病理分级、分期和肿瘤复发的关系。结果 BUC组织中MAD2阳性表达率明显高于正常膀胱黏膜组织,差异有显著性(χ2=13.68,P<0.01)。高级别和浸润性BUC组织中MAD2的阳性表达率明显高于低级别和浅表性BUC组织(χ2=12.25、4.33,P<0.05),复发BUC组织中MAD2阳性表达率与初发BUC组织比较差异无显著性(P>0.05)。MAD2高表达组病人中位生存期明显短于MAD2低表达组,差异有统计学意义(P=0.048)。结论 MAD2可作为BUC诊断的一个重要的免疫标记抗体,其检测可为BUC恶性程度的判定、预后分析及临床治疗提供有效的依据。

EGFP-MAD2融合基因表达载体的构建及功能验证

目的:构建绿色荧光蛋白(EGFP)与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(MAD2)融合基因表达载体,并初步验证融合基因的功能。方法:采用PCR技术扩增EGFP-MAD2融合基因,连接入T载体进行序列测定,随后克隆入逆转录表达载体p QCXIP-EGFP-N1获得重组质粒,采用脂质体转染293FT细胞,荧光显微镜观察融合蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期。结果:获得序列正确的EGFP-MAD2融合基因及其表达载体p QCXIP-EGFP-MAD2;EGFP-MAD2基因可在293FT细胞中表达;流式分析显示EGFP-MAD2表达的细胞G2/M期比例增加。结论:构建了EGFP-MAD2融合基因表达载体,EGFP-MAD2融合蛋白的表达可以诱导细胞发生G2/M期阻滞。

有丝分裂阻滞缺陷蛋白2选择性剪接体MAD2β在胃癌细胞多药耐药机制中的作用

目的 观察有丝分裂阻滞缺陷蛋白 2 (mitoticarrestdeficientprotein 2 ,MAD2 )基因的选择性剪接体MAD2 β在人胃癌多药耐药性形成过程中的作用机制。 方法 从耐阿霉素人胃癌细胞系SGC790 1/ADR中提取总RNA ,通过RT PCR获得MAD2 β全长编码cDNA ,并克隆至pUCm T载体 ,正向亚克隆插入真核表达载体pcDNA3.1中。以脂质体介导pcDNA3.1/MAD2 β真核表达载体转染胃腺癌细胞SGC790 1。以体外药敏试验检测转染MAD2 β的胃癌细胞及其对照组细胞对化疗药物的敏感性。通过流式细胞仪检测MAD2 β基因转染组和对照组胃癌细胞在细胞周期中的分布和细胞内阿霉素的荧光强度。结果 RT PCR扩增获得约 0 .5 3kb片段 ,DNA序列测定证实为MAD2的一种选择性剪接形式 ,命名为MAD2 β。重组正义真核表达载体pcDNA3.1/MAD2 β瞬时转染SGC790 1细胞 ,经MTT法证实 ,转染细胞SGC790 1/MAD2 β对化疗药物阿霉素、长春新碱和丝裂霉素的耐药性增强。与SGC790 1/pcDNA3.1比较 ,阿霉素大剂量短期作用后 ,SGC790 1/MAD2 β细胞内的平均荧光强度比对照组低 (P <0 .0 5 )。结论 MAD2 β基因在一定程度上增强了人亲本胃癌细胞SGC790 1对化疗药物的耐受性 ,其可能的机制为肿瘤细胞在化疗药物作用下 ,有丝分裂出现异常 ,耐药细胞通过调控MAD2?

喉鳞状细胞癌中MAD2的表达及临床意义

目的探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中有丝分裂阻滞缺陷蛋白(MAD2)的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学EliVision二步法检测55例LSCC组织、30例癌旁正常黏膜组织中MAD2蛋白的表达并分析其与LSCC临床病理特征的关系。结果 MAD2蛋白在LSCC组织中的阳性表达率为58.2%(32/55),低于癌旁正常黏膜组织86.7%(26/30),两者差异有统计学意义(P<0.01);中、低分化组MAD2阳性表达率为47.1%(16/34),低于高分化组76.2%(16/21),淋巴结转移组MAD2阳性表达率为35.0%(7/20),低于无淋巴结转移组71.4%(25/35),两组差异均有统计学意义(P均<0.05);MAD2阳性表达与患者性别、年龄、吸烟、肿瘤原发部位、T分期及临床分期无相关性(P均>0.05)。结论 MAD2蛋白在LSCC的发生、分化及转移中可起重要作用,可作为LSCC诊断及预后的参考指标之一。

干扰MAD2L1基因表达对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨干扰有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1(MAD2L1)基因表达对乳腺癌(BC)细胞凋亡的影响及其机制。方法采用qRT-PCR检测正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和4种BC细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3和BT-20)中MAD2L1 mRNA表达水平。将MAD2L1 siRNA转染至MDA-MB-231细胞中,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平;MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术法检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)和p38MAPK等蛋白表达水平。采用p38MAPK抑制剂SB203580联合处理上述细胞,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率的变化;Western blotting检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK和p38MAPK表达水平的变化。结果BC细胞系中MAD2L1 mRNA表达水平高于MCF-10A细胞,其中MDA-MB-231细胞最为显著。干扰MAD2L1基因可降低MDA-MB-231细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平(t_(mRNA)=10.51,P_(mRNA)<0.001;t_(蛋白)=18.30,P_(蛋白)<0.001),同时抑制细胞增殖(F_(组别)=243.36、F_(时间)=44.00、F_(组别×时间)=9.881,P均<0.001),促进细胞凋亡(t=9.10,P<0.001),并上调Bax、cleaved-caspase-3和p-p38MAPK蛋白表达水平(t_(Bax)=15.05,P_(Bax)<0.001;t_(cleaved-caspase-3)=5.26,P_(cleaved-caspase-3)=0.006;t_(p-p38MAPK)=28.46,P_(p-p38MAPK)<0.001),下调Bcl-2蛋白表达水平(t_(Bcl-2)=14.23,P<0.001)。然而,SB203580处理可抑制MAD2L1基因干扰对MDA-MB-231细胞凋亡的诱导作用(P=0.002)。结论干扰MAD2L1基因表达可抑制MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与激活p38MAPK信号通路有关。

上调的细胞周期相关蛋白在胃癌中的作用研究

目的进一步研究胃癌发病机制。方法富集分析3个GEO数据集筛选出的差异基因,利用STRING数据库绘制蛋白质相互作用图,使用Cytoscape软件筛选关键基因。通过TCGA数据库验证关键基因的差异表达。利用Western blotting和实时荧光定量PCR(qPCR)检测胃癌组织中细胞周期相关基因的蛋白和mRNA的表达水平。结果共筛选出203个差异表达基因,其中包括131个上调表达和72个下调表达基因。与癌旁组织相比,周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白B1(CCNB1)和有丝分裂停滞缺陷蛋白2(MAD2L1)在胃癌组织中明显上调表达(P<0.05)。在胃癌组织中,CCNB1和CDK1之间存在显著正相关关系(R=0.98,P<0.001)。Western blotting和qPCR结果显示,胃癌组织中CDK1、CCNB1和MAD2L1的蛋白和mRNA水平均上调表达(P<0.05)。结论CDK1、CCNB1和MAD2L1在胃癌组织中上调表达,有可能成为治疗胃癌的新的潜在生物标志物。