融合基因VH-mms13的构建及其蛋白表达鉴定

目的构建原核表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,诱导表达后鉴定融合蛋白表达。方法分别扩增单克隆抗体基因的重链可变区VH基因和细菌磁小体膜蛋白基因mms13基因,采用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension,SOE-PCR)构建融合基因VH-linker-mms13,并将融合基因插入pET30a(+)载体,酶切、测序验证;将重组质粒导入大肠杆菌DE3中,0.4 mmol/L异丙基疏代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blot双重鉴定。结果 PCR鉴定构建的融合基因VH-mms13大小为738 bp,与理论值相符,测序结果表明序列无误;转入DE3经IPTG诱导,在包含体中检测到融合蛋白表达;Western blot结果显示该表达蛋白可与His-tag抗体特异性结合,蛋白大小符合融合蛋白理论预期。结论成功构建了融合基因VH-mms13的表达载体p ET30a(+)-VH-mms13,且融合蛋白反应原性良好,为生物磁靶向药物的研发奠定了基础。

融合蛋白ScFv(3G11)-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a(+)质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5a中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a(+)-ScFv-mms13构建成功。SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0.2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a(+)-ScFvmms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。

ScFv(3G11)-mms13融合基因克隆及表达载体构建

目的通过重叠延伸拼接PCR(SOE-PCR)技术克隆融合基因ScFv(3G11)-mms13并构建融合蛋白表达载体pET30a(+)-ScFv(3G11)-mms13,为重组制备肿瘤靶向细菌磁小体提供转基因载体。方法根据mms13基因和ScFv(3G11)基因的序列,设计以PCR引物,以克隆载体pMD18-mms13和pMD18-ScFv为模板,采用SOE-PCR技术构建融合基因ScFv-Linker-mms13。进而将融合基因ScFv-mms13与pET30a(+)连接构建重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,测序后应用软件DNAMAN进行分析。结果应用重叠延伸拼接PCR方法构建融合基因ScFv-linker-mms13(1158bp),然后通过克隆技术得到重组质粒pMD18-ScFvmms13。将融合基因ScFv-Linker-mms13插入到pET30a(+)构建了重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13;菌落PCR、酶切、DNA测序鉴定结果均表明目的片段准确地插入到表达载体中。结论通过SOE-PCR技术扩增了预先设计的长达1158bp的融合基因片段ScFv-Linker-mms13,并成功构建了重组质粒pMD18-ScFv-mms13及重组表达载体pET30a(+)-ScFv-mms13,为磁小体用于肿瘤靶向治疗研究提供了实验材料。

25Mn钢Φ185mm×13mm冷拔管内表面麻点状缺陷的分析和控制工艺

25Mn钢(/%:0.24C,0.25Si,0.87Mn,0.016P,0.011S)冷拔管的生产流程为铁水预处理-90tEAF-LFVD-Φ250 mm圆坯HCC-穿孔-热轧至Φ197 mm×17 mm管-冷拔至Φ185 mm×13 mm管。采用光学、扫描电子显微镜、能谱仪和电子探针分析了25Mn钢冷拔管内表面麻点状缺陷。结果表明,麻点状缺陷呈翘皮状和凹坑状,翘皮状缺陷成因是CaO-Al_2O_3-(MgO)复合夹杂与钢基体变形量不一,凹坑状缺陷成因是Al_2O_3-MnS-CaS复合夹杂聚集长大后磨削加工过程中脱落。通过将原铝脱氧精炼工艺优化成硅钙合金脱氧工艺,使精炼渣碱度由原6.76降至2.26,精炼渣中(MgO)由原5.33%提高至7.23%,(Al_2O_3)由26.05%降低至12.76%,使钢中的硬脆性夹杂转变为延展性优良的硅酸盐类夹杂,消除了25Mn钢冷拔管内表面麻点状缺陷。