mmu-miR-3475-3P在心脏发育中的生物信息学分析

目的探讨mmu--miR-3475-3P可能参与的生物学过程及信号通路。方法用实时荧光定量PCR方法测定mmumiR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中的表达。再综合应用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在线数据库对miR3475-3p进行靶基因预测,对所得靶基因进行基因功能注释(Go)和信号通路分析。结果 mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏和成熟心脏中存在明显的表达差异,运用TargetScan、miRDB、miRanda对miR3475-3P进行生物信息学分析发现该microRNA可能调控441个靶基因。结论 mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心脏高表达,其预测的靶基因富集于多个信号通路及细胞生物学过程。

靶向调控前列腺素内过氧化物合成酶2基因抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化

背景:骨质疏松症可归因于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的不平衡。成骨细胞是骨形成的基础,对于骨骼的生长和维持必不可少,成骨细胞功能的紊乱会导致骨骼生长发育不良和骨质疏松症。然而目前对于成骨细胞成骨分化过程中的关键基因仍不清楚。目的:使用生物信息学鉴定MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因及其上游miRNA,并验证其对MC3T3-E1细胞成骨分化和增殖的影响。方法:从基因表达综合数据库(GEO)下载基因表达谱GSE46400成骨诱导数据,使用R语言limma包获得差异表达基因。利用DAVID数据库对DEGs进行了基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析。通过STRING网站建立蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络并利用CytoHubba插件筛选网络中的重要模块,以鉴定其中的关键基因。培养MC3T3-E1细胞并分别转染siRNA和miRNA,转染72 h后进行实时荧光定量PCR检测前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase,Ptgs)2和骨化相关水平变化,转染72 h后进行Western Blot检测PTGS2蛋白水平变化;转染14 d后进行碱性磷酸酶定量检测;转染21 d后进行茜素红染色及定量检测。结果与结论:(1)筛选出差异表达基因229个,其中114个基因表达上调,115个基因表达下调。富集在骨矿化生物学过程的5个基因:Mmp13,Ibsp,Gpnmb,Ptgs2及Aspn均为显著高表达。进一步使用CytoHubba鉴别高表达差异基因中的核心模块中只有Ptgs2参与骨矿化生物学过程,即定义Ptgs2为成骨分化过程的关键基因。(2)通过Targetscan对Ptgs2上游miRNA进行预测,发现mmu-miR-107-3p可以靶向调控Ptgs2。(3)在MC3T3-E1细胞中敲减Ptgs2后可以显著抑制细胞增殖和成骨分化(P<0.05);在转染mmu-miR-107-3p后,细胞的增殖和成骨分化同样被抑制。(4)双荧光素酶报告基因结果显示mmu-miR-107-3p可以直接靶向抑制Ptgs2的转录(P<0.05)。(5)mmu-miR-107-3p可以通过靶向Ptgs2进而抑制MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化,Ptgs2可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的关键基因。

羊种布鲁杆菌介导的mmu-miR-149-3p靶基因的初步鉴定

布鲁杆菌病是由布氏杆菌(Brucella)引起的一种急性或慢性人兽共患传染病,在我国,羊种布鲁杆菌(Brucella melitensis,B.melitensis)最为流行。前期研究发现,mmu-miR-149-3p的潜在靶基因有10个,分别为:Bcl6b、Nos2、Slc7a11、Olr1、Ikbke、Slc31a2、IL1rl1、Dusp16、Ifit1和Rhoc。本试验通过X-treme Gene高效转染试剂,分别将5,50和100 nmol/L,Cy3标记的mimics转染至RAW264.7细胞24 h后,流式细胞仪分析,筛选出最佳转染mimics的浓度;并将mmu-miR-149-3p mimics与mmu-miR-NC mimics,按照最佳转染浓度,转染至RAW264.7细胞24 h后,加入TRIzol裂解细胞,提取总RNA,转录组获得cDNA;利用NCBI primer设计mmu-miR-149-3p的10个潜在靶基因的特异性引物,运用qRT-PCR方法,进行验证试验。结果发现,转染Cy3标记的mimics最佳浓度为100 nmol/L,其阳性率为49.94%,平均荧光强度为18.74;与mmu-miR-NC mimics转染组相比,在mmu-miR-149-3p mimics转染组中,Olr1、Slc7a11和IL1rl1的相对表达量显著降低。结果初步表明,mmu-miR-149-3p的靶基因为Olr1、Slc7a11和IL1rl1。这为揭示mmu-miR-149-3p在B.melitensis侵染巨噬细胞过程中的功能奠定了基础,还为进一步阐释B.melitensis的感染机制以及防控布病提供了参考。