环状RNA-42398在肝纤维化模型中的表达变化及功能

目的:明确环状RNA-42398(mmu_circ_42398)在肝纤维化动物模型肝组织和细胞模型中的表达变化,并初步探讨其生物学功能。方法:制备小鼠肝纤维化动物模型,复制小鼠肝星状细胞(JS1)活化模型、小鼠肝细胞(AML12)氧化应激损伤模型、小鼠巨噬细胞炎症(RAW264.7)模型,分别设立正常组,qPCR检测mmu_circ_42398在上述模型肝组织和细胞中的表达变化,进一步采用生物信息学方法预测其靶基因,分析其生物学功能,绘制其ceRNA信号通路网络图。为了验证其功能,构建mmu_circ_42398过表达载体,将其转染至JS1细胞,然后检测细胞内a-SMA、ColI蛋白的表达改变。结果:相比对照组,mmu_circ_42398在小鼠肝纤维化模型肝组织中表达显著降低(P<0.05),在JS1活化、AML12氧化应激损伤、RAW264.7炎症损伤3种细胞模型中表达均显著降低(P<0.05)。生物信息学分析预测mmu_circ_42398可能通过结合靶基因miR-338-3p从而影响肝星状细胞的活化。在JS-1细胞中过表达mmu_circ_42398后,a-SMA、ColI蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:mmu_circ_42398表达在肝纤维化模型中发生了明显变化,其可能通过抑制肝星状细胞的活化,参与了肝纤维化的进展。

环状RNA 42398调控转化生长因子-β1/Smad信号通路在大鼠胆道闭锁肝纤维化中的作用机制

目的探讨环状RNA(circRNA)42398调控转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路在大鼠胆道闭锁肝纤维化中的作用机制。方法取大鼠肝星状细胞株HSC-T6构建慢病毒稳定感染的细胞系,根据转染RNA的不同将细胞分为阴性对照组、circRNA过表达组和circRNA敲低组。阴性对照组细胞转染阴性对照序列,circRNA过表达组细胞转染circRNA过表达序列,circRNA敲低组细胞转染circRNA低表达序列。应用细胞计数试剂盒-8检测各组细胞活性,采用实量定量聚合酶链式反应检测各组细胞中TGF-β1、Smad2和Smad3 mRNA的表达,采用Western blot法检测各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表达。结果各组细胞活性比较差异均无统计学意义(P>0.05)。circRNA过表达组与阴性对照组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。circRNA敲低组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA和蛋白的相对表达量均显著高于阴性对照组(P<0.05)。结论在大鼠细胞水平,circRNA 42398可通过调控TGF-β1/Smad信号通路而抑制肝星状细胞活化,从而抑制胆道闭锁肝纤维化,这为胆道闭锁肝纤维化的治疗和预防提供了依据。

黄芪总皂苷调节环状RNA34116表达阻止肝纤维化进展

目的:探讨黄芪总皂苷(AST)对肝纤维化模型的干预作用,并从环状RNA(circRNA)的角度分析其作用机制。方法:小鼠随机分为正常组、CCl_4模型组、CCl_4+AST组、CCl_4+索拉菲尼组,每组8只。制备CCl_4小鼠肝纤维化模型,给予AST和索拉菲尼干预后,用生化试剂盒检测血清肝功能,制作石蜡切片观察肝组织病理学变化(HE染色、Masson染色),RT-PCR检测各组环状RNA34116(mmu_circ_34116)表达变化。结果:组织病理检测显示,与正常组比较,CCl_4模型组肝组织炎症反应和胶原表达显著增加;AST、索拉菲尼干预后,肝组织炎症显著减轻,胶原表达显著减少(P<0.05);血清肝功能检测显示,与正常组比较,CCl_4模型组血清ALT、TBIL水平显著上升(P<0.01);AST、索拉菲尼干预后ALT、TBIL水平显著下降(P<0.01);RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,CCl_4模型组肝组织mmu_circ_34116表达量显著降低(P<0.01);AST干预可显著增加mmu_circ_34116的表达量(P<0.01);而索拉菲尼对mmu_circ_34116的表达量无显著影响(P>0.05)。结论:AST显著阻止肝纤维化模型的肝纤维化进展,其机制可能与调节mmu_circ_34116表达有关。

环状RNA mmu_circ_0001083对牛肠道病毒HY12复制的影响

环状RNA(circRNA)是一类特殊的呈闭合环状结构的非编码RNA,参与多种生物学过程,如细胞增殖、分化和凋亡,在多种疾病发生中发挥重要作用,同时也是潜在的生物标志物和治疗靶点。为探索circRNA对病毒复制的影响,本研究对HY12肠道病毒感染MC38细胞的circRNA差异表达进行了组学测定与分析,发现在HY12病毒感染后有570个circRNA表达水平上调,381个circRNA表达水平下调。在570个表达上调的circRNA中,选择差异显著上调的circRNA mmu_circ_0001083为研究对象,探讨其与HY12感染之间的关联以及对病毒复制的影响。结果显示,HY12病毒感染细胞后,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达显著上升,且其表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。与感染正常MC38细胞相比,HY12病毒感染环状RNA mmu_circ_0001083敲低的MC38细胞后,其2C蛋白表达减少,病毒滴度显著降低。相反,HY12病毒感染过表达环状RNA mmu_circ_0001083的MC38细胞后,其2C蛋白表达增加,病毒滴度明显升高。上述结果表明,宿主环状RNA mmu_circ_0001083的表达上调与HY12病毒感染复制呈显著正相关,即mmu_circ_0001083对HY12的复制起到了正向调控的作用,该结果为今后深入研究环状RNA对HY12病毒复制的调控机制打下基础。

mmu_circ_0001033过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。方法首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来,通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。结果经过比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致,表明质粒构建成功。PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确。将构建的过表达载体测序结果和质粒构建方案基因比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列与预期完全一致,可实现转染质粒后目的基因的表达,PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。最后通过比较RT-qPCR测定病毒滴度值为2.09×10^(8) TU/ml。结论成功构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,能稳定转染293T细胞,可用于后续细胞实验。