基于荧光SSR的宁夏糜子DNA分子身份证的构建

糜子(Panicum miliaceum L.)种质资源丰富,在干旱环境中具生产优势,基于荧光SSR标记构建其DNA分子身份证可为资源的数字化管理提供理论依据和分子检测工具。本文以274份宁夏糜子核心种质为试验材料,对山西农业大学前期开发的糜子特异性SSR标记进行多次PCR筛选和优化后获取核心引物。基于糜子参考基因组信息,经过BLAST序列比对后将核心标记进行染色体定位。在SSR引物的5′端标注荧光(FAM/HEX),利用毛细管电泳给出材料的基因型,采用“0,1”二进制编码方式记录扩增条带的有无,使用IDAnalysis 4.0检测材料的区分程度。采用十进制(0~9)统计扩增片段大小以获得材料的字符串分子身份证。使用Popgene、Powermarker、MEGA、NTSYS进行遗传多样性、遗传聚类和主成分分析。利用二维码在线软件(https://cli.im/)给出材料的二维码DNA分子身份证。PCR扩增结果发现,10个荧光SSR(RYW6、RYW125、RYW43、RYW3、RYW40、RYW37、RYW42、RYW8、RYW28和RYW124)组合在一起可以将274份材料全部区分开。BLAST结果表明,RYW124分布在12号染色体上,位于7.8 cM处;RYW40分布在4号染色体上,位于42.64 cM处;RYW42分布在13号染色体上,位于34.63 cM处,RYW28分布在16号染色体上,位于2.34 cM处,RYW8分布在3号染色体上,位于9.90 cM处。274份材料在10个位点共检出125个等位变异,平均每个位点为12.5个,变幅为5.0000(RYW3)~25.0000(RYW6);检出的Shannon多样性指数(I)为1.2458(RYW3)~2.6568(RYW6),平均为1.8532;观测杂合度(Ho)为0.5185(RYW40)~0.9964(RYW124),平均为0.8674;期望观测杂合度(He)为0.5724(RYW40)~0.9108(RYW42),平均为0.7784;Nei’s基因多样性指数(Nei)为0.5711(RYW40)~0.9091(RYW42),平均为0.7767;多态性信息含量(PIC)为0.6563(RYW3)~0.9602(RYW42),平均为0.8399。聚类分析和主成分分析均将材料划归4个类群。将电泳条带进行数字编码,利用10个标记组合,构建了全部材料的字符串和二维码DNA分子身份证。

东北春播区糜子核心种质的荧光微卫星标记鉴定

优异种质资源是糜子新品种选育和产业发展的基础。本研究以190份东北春播区糜子核心种质为材料,利用前期构建的SSR标记在5'端标注荧光,进行PCR扩增和毛细管电泳。根据毛细管电泳检测的片段有无采用“0/1”表示,利用ID Analysis4.0进行区分,使用PopGene、PowerMarker、MEGA、Structure、NTSYS进行遗传多样性分析。试验结果表明,3个荧光SSR标记组合(RYW3+RYW6+RYW28)可区分190份材料,共检测出等位变异73个,平均为24.3333;有效等位基因数(Ne)为5.4728(RYW3)~15.8922(RYW6),平均为9.6496;检出Shannon多样性指数(I)为2.0851(RYW3)~2.9457(RYW6),平均为2.4896;观测杂合度(Ho)为0.7529(RYW6)~0.9574(RYW28),平均为0.8876;期望观测杂合度(He)为0.8194(RYW3)~0.9398(RYW6),平均为0.8765;Nei’s基因多样性指数(Nei)为0.8173(RYW3)~0.9371(RYW6),平均为0.8741;多态性信息含量(PIC)为0.8656(RYW3)~0.9722(RYW6),平均为0.9198。基于UPGMA将190份资源划分为3个群组。基于Structure的遗传结构分析(K=3)将糜子核心种质分为3个类群,来源于东北地区的4个基因库(黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古的一部分)。基于主成分分析将材料分为4个类群,与地理来源一致。利用在线二维码技术(https://cli.im/)构建了190份东北糜子核心种质的DNA分子身份证。

东北春播区糜子核心种质及其DNA分子身份证构建

本研究以500份东北春播区糜子资源为材料,利用169个SSR标记,采用UPGMA聚类分组,进行分层抽样,构建核心种质,同时应用ID Analysis 4.0软件构建分子身份证。利用等位基因数(Na)等遗传多样性衡量指标评估核心种质的遗传差异,并利用PCOA分析核心种质。结果表明,对169对SSR引物进行筛选,发现30对多态性好,利用30对SSR引物构建的糜子核心种质包含190份材料,占全部种质的38%,全部种质与核心种质的均检测出91个等位变异,保留了100%等位基因;有效等位基因数为2.2977~2.9975和2.2872~3.0173,平均值分别为2.8198和2.8297;Shannon多样性指数为0.9532~1.0990和0.9535~1.1162,平均值为1.0645和1.0667;观测杂合度为0.3434~0.8037和0.3162~0.7849,平均值为0.5399和0.5359;期望杂合度为0.5654~0.6672和0.5645~0.6707,平均值为0.6448和0.6473;Nei’s基因多样性指数为0.5648~0.6664和0.5628~0.6686,平均值为0.6441和0.6452;多态性信息含量为0.6657~0.8356和0.6493~0.8340,平均值为0.7974和0.7944。全部种质与核心种质的分子标记的相关指标进行t检验,结果无显著性差异,且PCOA分析表明核心种质与全部种质具有相似的遗传多样性和群体结构,同时发现8个SSR标记(RYW5、RYW8、RYW16、RYW28、RYW40、RYW53、RYW62和RYW67)可区分190份核心种质,构建了东北糜子核心种质的分子身份证。

贵州荞麦重要种质的遗传多样性分析及分子身份证构建

为精准鉴定贵州荞麦种质资源,采用SSR分子标记对60份荞麦种质进行遗传多样性分析,构建DNA分子身份证数据库。结果显示,从100对SSR引物中筛选出16对稳定性好、多态性丰富的引物,在60份供试种质中共扩增出174个多态性条带;Shannon’s信息指数、Nei’s多样性指数、多态信息指数均值分别为0.337、0.206、0.693,引物的多态性较好,能有效揭示60份荞麦种质的遗传多样性;在Dice遗传相似系数为0.374时,所有供试材料可聚为A、B、C三组;当Dice遗传相似系数为0.484时,将苦荞组(A组)更细分为A1、A2两个小组。采用毛细管电泳及8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对SSR标记扩增产物进行双验证,2种方法的聚类结果一致。结果表明,本研究开发的高效性SSR分子标记能够有效地鉴定贵州荞麦重要种质的遗传多样性且用于构建分子身份证。

基于SRAP标记的国兰种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建

【目的】探究国兰种质资源遗传多样性水平,并构建分子指纹图谱及分子身份证,为在分子水平上鉴定国兰种质提供技术支撑,也为国兰种质资源开发、保存利用及种质创新奠定基础。【方法】以收集于华南及邻近地区的139份国兰栽培品种和野生种质为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,由13条正向引物和16条反向引物随机组成208对SRAP引物,每对引物用品种‘宋梅’和‘大勋’扩增产物进行筛选;PCR扩增产物应用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳胶图进行人工读带,并计算多态性引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态性条带比率。按照Botstein公式计算多态信息含量;用POPGENE32软件计算观测等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数、Shannon’s信息指数,并进行遗传多样性分析。用NTSYS-pc2.10e软件UPGMA方法进行聚类分析,并计算遗传相似性系数。采用引物对组合的方法,构建139份国兰种质资源数字指纹图谱。【结果】从208对SRAP引物中共筛选出17对多态性好且重复性高的引物,对供试材料进行PCR扩增,共扩增出DNA条带489条,其中多态性谱带484条,多态性比率(PPB)为98.89%,观测等位基因数平均值为2.00,多态性信息含量平均值为0.94,每个位点的有效等位基因数平均值为1.49,Nei’s基因多样多样性指数平均值为0.30,Shannon信息指数平均值为0.45。UPGMA聚类分析表明,139份国兰种质资源的遗传相似系数变化范围为0.51—0.91。在相似系数为0.70时,可划分为6个类群。用SRAP多种引物组合方法可有效区分所有材料,并构建出139份国兰种质资源特异性分子身份证,置信概率达到99.99%。根据聚类结果可以将国兰种质分为4组:一为春兰组,由春兰种质单独构成;二为建墨兰组,主要由建兰和墨兰种质组成;三为寒蕙兰组,主要由寒兰、蕙兰和杂交系组成;四为剑莲兰组,由春剑和莲瓣兰种质组成。而四组之间剑莲兰组与寒蕙兰组亲缘关系最近,与建墨兰组次之,与春兰组亲缘关系较远。【结论】所试国兰种质具有较丰富的遗传多样性水平,基于17对SRAP引物组合所构建的139份国兰种质的分子身份识别体系具有唯一性和高效性,SRAP标记是在分子水平鉴定国兰种质的有效方法之一。

亚麻RAPD标记分子身份证体系的构建与遗传多样性分析

本试验选用了1480条RAPD引物,以26份国内外亚麻种质资源或品种为材料,进行了引物筛选。筛选出了32条多态性比较好的引物,32个RAPD标记共产生79个多态性条带,多态性比率为44.4%。并利用这32条引物对26份材料进行了遗传多样性分析,利用UPGMA法做聚类图,计算其遗传相似系数。将26份材料分为3个类群。在筛选出的32个RAPD引物中选出多态性好,特异性好的10个核心引物,编号分别为:S1047、S1230、S1238、S1270、S1314、S1353、S2105、SC07、SH04、ST09。利用这10个核心引物构建了26份亚麻材料的DNA指纹图谱,并将条带的有或无转化成1或0,每份材料构成了一组71位数二进制数据,将每份材料的二进制数据转换为22位的十进制数据,构成了每份材料的分子身份证,初步建立亚麻RAPD标记分子身份证体系。

利用荧光SSR标记构建欧李种质分子身份证

以19个欧李优异种质及其近缘种为试验材料,利用荧光SSR标记构建分子身份证。从欧李近缘属植物中筛选出多态性高、稳定性好的13对引物,对19个欧李品种及其近缘种杏李、李资源的遗传多样性和亲缘关系进行分析。结果表明:共检测到等位基因数88个,每对引物检测到的等位基因数在2~12个,平均6.7个;共检测到等位基因片段98个,每对等位基因检测到的等位基因片段数在3~12个,平均7.5个。多态信息含量变幅在0.2961~0.8533,平均为0.6297;Shannon信息指数变幅在0.5474~2.1799,平均为1.4352。同时,基于SSR分析结果得到编码各异的品种分子身份证,该分子编码可以将亲缘关系不同的欧李品种进行有效区分;聚类分析显示19个欧李品种及其近缘种根据亲缘关系远近聚为不同类群。结果说明,SSR标记在蔷薇属种间具有通用性,且是欧李种质鉴定及其分子身份证构建的有效手段。

基于表型性状和SSR标记的板栗品种遗传多样性分析及分子身份证构建

本研究以55个板栗品种为材料,对这些板栗品种的单粒重量、横径长度和纵径长度等14个表型性状进行测定及分析,部分板栗品种形态性状指标差异不显著,仅利用表型性状很难进行准确的品种鉴定。因此本研究基于板栗全基因组序列开发SSR标记,并对55个板栗种质资源进行PCR扩增,利用POPGENE32、PowerMarker V3.25和NTSYS Version 2.10软件对SSR标记数据进行分析,筛选出6对多态性较好的SSR引物。6对引物共检测到31个等位基因,多态位点百分率达100%,多态性信息含量指数、Nei′s基因多样性指数、Shannon′s多态性信息指数、观测杂合度和期望杂合度的平均值分别为0.651、0.696、1.358、0.524、0.703。利用筛选出的6对引物能够明确区分供试的55份板栗品种,并构建了55个板栗品种的字符串、条形码和二维码分子身份证。本研究利用表型性状和SSR标记研究板栗品种的遗传多样性,构建板栗品种的分子身份证,为板栗种质资源的品种鉴定、合理利用和有效保护提供理论参考。

山西省糜子DNA分子身份证的构建

[目的]利用SSR引物对山西省的糜子种质资源进行划分和管理,通过DNA碱基上的区别,制作符合碱基引物的字符串和条形码,与糜子的种质信息结合,生成DNA分子身份证,以便快速鉴定山西省糜子的种质及其特性。[方法]以来源于山西省的20份糜子资源为材料,利用高基元SSR标记(五、六碱基)进行DNA扩增,并用软件PowerMarker 3.25和PopGen 1.32计算山西省的遗传多样性参数。利用条形码在线软件http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php和在线二维码技术https://cli.im/构建DNA条形码和二维码分子身份证。[结果]20份材料在10个等位位点共检测出等位变异10个,观测等位基因为3.0000;有效等位基因为2.5412~2.9862,平均为2.8088;多样性指数为1.0115~1.0963,平均为1.0633;期望杂合度为0.6238~0.6841,平均为0.6433;Nei’s期望杂合度为0.6065~0.6651,平均为0.6433;多态性信息含量为0.5711~0.7962,平均为0.6962,14对碱基引物中有10对引物(RYW1、RYW2、RYW3、RYW5、RYW6、RYW7、RYW8、RYW10、RYW12、RYW14)扩增稳定、多态性好,可用于构建分子身份证,其中RYW1、2、3为六碱基引物,RYW5、6、7、8、10、12、14为五碱基引物。[结论]构建了20份糜子种质的DNA条形码和二维码分子身份证,可为山西省的糜子的种质资源保护及快速鉴定提供科学理论依据。

基于高基元SSR构建黍子DNA分子身份证

为了系统管理和区分鉴别黍子(Panicum miliaceum)资源,建立大数据管理平台,为种质身份标识的研究与鉴定提供理论依据,实现管理的科学规范化,选取来自于华北平原、黄土高原、东北平原等不同地理区域的20份黍子材料,基于30对高基元SSR引物(6、5、4碱基各重复4、10、21对)进行遗传多样性分析;利用PowerMarker3.25、PopGen 1.32和MEGA 5.0软件计算遗传多样性参数和遗传距离聚类,利用Ntsys 2.11和ID Analysis 4.0分别进行主成分分析和引物组合优化,利用在线条形码生成器(http://barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.php)和在线二维码生成器(http://cli.im)生成条形码和二维码DNA分子身份证。结果表明,所选取的35对引物中10对引物可作为候选核心引物,这10对引物共检测出等位变异10个,有效等位变异为2.168 2~2.985 1个,平均为2.636 7个;Shannon多样性指数为0.899 7~1.096 1,平均为1.020 6;观测杂合度为0.473 7~0.833 3,平均为0.677 7;期望观测杂合度为0.553 3~0.682 1,平均为0.635 0;Nei’s基因多样性指数为0.538 8~0.665 0,平均为0.617 3;多态性信息含量为0.526 2~0.749 3,平均为0.657 9。用5对引物组合(RYW8、RYW12、RYW5、RYW2、RYW1)可将全部材料区分,在线二维码生成器中输入各黍子的名称、统一编号、生态区、来源、字符串等信息,成功构建了20份黍子资源的DNA分子身份证。

基于InDel标记的大白菜育种材料分子身份证构建

以105份大白菜育种材料为试材,精选20对均匀分布于大白菜基因组、且只能检测出2个等位基因的共显性InDel标记引物进行分子标记检测,构建分子身份证。结果表明:20对引物中有16对引物在所有材料中均扩增出单一条带,另外各有2对引物在部分材料中存在缺失和加倍现象。将所有标记引物按其所处染色体编号由小(A01)到大(A10)排列,同一染色体上的标记则按照物理位置从小到大排列,按顺序对标记赋值,构建了105份大白菜材料的分子身份证。所筛选的20对引物对未知新种质的身份证构建具有通用性和兼容性,表明InDel标记技术可以作为大白菜鉴定和分子身份证构建的有效技术手段。

茶树叶绿体基因组SNP分子标记的初步研究

传统的叶绿体基因分子标记在茶组植物分类系统研究中的应用价值相对有限,为了筛选可用于茶树鉴别与母系溯源的SNP(单核苷酸多态性)位点组合,将18个已报道的茶组植物叶绿体全基因组序列进行比对,通过设计通用引物,在169个茶树品种/品系中进行候选分子标记扩增与一代测序分析,筛选出16对引物,共含25个SNP位点可用于茶树品种母系溯源与鉴别分析。另外,将SNP位点组成的DNA指纹图谱结合茶树品种资源基本信息进行数字编码,最终形成由30位数字组成的茶树品种资源分子身份证,并构建相应的条形码和二维码用于品种识别。本研究数据为茶树品种的母本溯源与鉴别提供新的思路。

基于表型性状和SSR标记的半夏遗传多样性分析及分子身份证构建

目的:研究半夏种质间遗传多样性,解析种质间的亲缘关系,为半夏种质鉴定、品种选育及资源保护提供依据。方法:该研究以27份半夏作为实验材料,测定其株高、叶长、叶宽等7个表型性状,并基于半夏转录组数据开发设计简单重复序列(SSR)引物,对27份半夏进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,利用POPGENE32、PowerMarker V3.25和NTSYS-PC 2.10e软件对半夏种质进行遗传多样性分析。结果:共筛选出10对具有高度多态性的引物(PIC>0.5),4对中度多态性的引物(0.25<PIC<0.5)。平均检出等位基因3.9286个,平均Nei's多样性指数(H)和Shannon's指数(I)分别为0.5578和1.0029,表现出较高的遗传多样性水平。聚类分析将半夏种质分为7个亚类,同一省份的半夏聚类在相同亚类。采用14对引物构建了27份半夏种质的SSR分子身份证,实现了对每个地区半夏的快速鉴别。结论:研究结果可为后续半夏的遗传多样性和居群结构研究奠定基础,并为半夏种质资源的鉴定、图谱构建和分子辅助育种提供科学依据。

青钱柳全基因组SSR位点分析及多态性引物开发

【目的】通过对青钱柳全基因组序列分析,开发基因组SSR分子标记;尝试构建19个青钱柳优良药用无性系的DNA分子身份证,为后续种质资源评价、遗传多样性和种质鉴定提供技术支撑。【方法】利用MISA(microsatellite identification tool)软件对青钱柳全基因组进行SSR位点搜寻、筛选、识别及富集分析,采用Primer 3.0进行SSR引物设计;用重复性和稳定性高的SSR标记构建青钱柳无性系的识别系统。【结果】(1)从全基因组中共检测出89741个SSR位点,SSR位点的发生频率为62.07%。(2)基因组SSR位点中单核苷酸重复单元比例最高,占总SSR位点的62.67%;六核苷酸重复单元比例最低,占0.15%;SSR位点的重复基序大多以(A/T)n为主。(3)单核苷酸和二核苷酸重复类型的SSR位点基序重复次数集中在6~16次;随重复次数增加,各SSR位点重复类型出现频率均呈下降趋势。(4)基因组SSR序列长度介于10~476 bp,不同类型重复单元的SSR序列长度存在变异性;随着重复次数的增加,SSR序列出现的频率整体呈下降趋势。(5)利用Primer 3.0成功设计出78285对SSR引物;合成的377对中有75对引物可扩增出多态性条带;用5对单碱基重复的多态性SSR引物分析19个药用无性系,构建出无性系的二维码DNA分子身份证。【结论】青钱柳基因组SSR位点出现频率高,位点种类丰富,可为种质资源评价及指纹图谱的构建提供丰富的候选分子标记。