莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:探讨多激酶抑制剂莫特塞尼联合果蝇zeste基因增强子的人类同源物2 (EZH2)抑制剂GSK126对肝癌Huh7细胞体外增殖和凋亡的影响,初步阐明其相关机制。方法:不同浓度(0、1、5、10、20、40和60μmol·L^(-1))莫特塞尼处理Huh7细胞,采用CCK-8法检测各组Huh7细胞增殖率,采用Western blotting法检测不同浓度(0、2.5、5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1))莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和磷酸化EZH2 (p-EZH2)蛋白表达水平。莫特塞尼和GSK126联合作用于Huh7细胞,采用CCK-8法和克隆形成实验确定后续实验合适的药物浓度。Huh7细胞分为对照组、莫特塞尼(10μmol·L^(-1))组、GSK126 (5μmol·L^(-1))组和联合组(莫特塞尼+GSK126),采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色法检测各组Huh7细胞增殖率,流式细胞术检测各组Huh7细胞凋亡率,Western blotting法检测各组Huh7细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化ERK (p-ERK)、蛋白激酶B (AKT)和磷酸化AKT (p-AKT)蛋白表达水平。结果:CCK-8法检测,不同浓度莫特塞尼组Huh7细胞存活率随着药物浓度升高逐渐降低,与0μmol·L^(-1)莫特塞尼组比较,20、 40和60μmol·L^(-1)莫特塞尼组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01);Western blotting法检测,与0μmol·L^(-1)莫特塞尼组比较,5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1)莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和p-EZH2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。通过CCK-8法和克隆形成实验确定10μmol·L^(-1)莫特塞尼和5μmol·L^(-1) GSK126用于后续实验。与对照组比较,莫特塞尼组、GSK126组和联合组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01);与莫特塞尼组和GSK126组比较,联合组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与对照组、莫特塞尼组和GSK126组比较,联合组Huh7细胞中p-AKT和p-ERK蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:单独应用莫特塞尼抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进凋亡效果不明显,可能与EZH2升高导致细胞耐药有关。莫特塞尼与GSK126联合应用可通过抑制AKT和ERK信号通路,增强莫特塞尼对肝癌Huh7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。

BRAF调节RAF/MEK/ERK信号通路在莫替沙尼治疗甲状腺癌中的作用

目的探讨BRAF调节迅速加速纤维肉瘤蛋白(RAF)/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在莫替沙尼治疗甲状腺癌中的作用。方法采用随机数字表法将90只BALB/C裸鼠随机分为对照组、模型组和治疗组,每组30只。选用由小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3HOOK3-RET所构建的稳定的甲状腺癌细胞株,构建BALB/C裸鼠皮下移植甲状腺癌模型。治疗组和模型组BALB/C裸鼠在成功构建皮下移植甲状腺癌模型后分别给予莫替沙尼50mg/kg和0.9%氯化钠溶液50mg/kg腹腔注射治疗1个月,对照组BALB/C裸鼠未构建皮下移植甲状腺癌模型,给予0.9%氯化钠溶液50mg/kg腹腔注射治疗1个月。按照caspase3活性检测试剂盒说明书检测治疗组、模型组BALB/C裸鼠甲状腺癌组织和对照组BALB/C裸鼠甲状腺组织中caspase3活性,采用蛋白质印迹法(Westernblot)和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分别检测上述各组织中BRAF、RAF、MEK、ERK、核因子-κB(NF-κB)蛋白和mRNA的相对表达量,采用免疫组化法检测BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度。结果治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中caspase3活性高于模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织和对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织(P<0.05);治疗组和模型组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白、NF-κBmRNA的相对表达量均低于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织(P﹤0.05),BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白和mRNA的相对表达量,及BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均高于对照组BALB/C裸鼠的甲状腺组织(P﹤0.05);治疗组BALB/C裸鼠的甲状腺癌组织中NF-κB蛋白和mRNA的相对表达量均高于模型组,BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白和mRNA的相对表达量,及BRAF、RAF、MEK、ERK蛋白的平均光密度均低于模型组(P﹤0.05)。结论莫替沙尼对甲状腺癌具有一定的治疗作用,并可以通过调节BRAF所诱导的RAF/MEK/ERK信号通路促进甲状腺癌细胞死亡。