小檗碱干预脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S分泌NO、IL-6等炎性介质的机制研究

目的:观察小檗碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌炎性介质的影响,并探讨其可能的机制。方法:体外培养小鼠肺泡巨噬细胞MH-S,用终浓度为0.5μg/ml的LPS刺激后,加入不同浓度的小檗碱作用24 h。MTT法检测小檗碱对MH-S活力的影响;采用NO测定试剂盒检测NO的含量,ELISA和RT-PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的蛋白和mRNA水平;Western blot法检测MH-S细胞中iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65的水平。结果:小檗碱在浓度不超过5μmol/L时,在24 h内对MH-S细胞的活力几乎无影响,在10μmol/L的浓度下对巨噬细胞的活力有抑制作用,并呈一定的时-效性。小檗碱能够显著降低MH-S细胞中NO的分泌量(P<0.05),并在蛋白和基因层面上剂量依赖性地降低TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的水平。小檗碱能够显著下调iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65的表达量(P<0.05)。结论:小檗碱能够抑制iNOS的活性,从而减少NO的分泌,同时通过抑制TLR4/MyD88/IRAK-4通路而抑制NF-κB的激活,进而发挥抗炎作用。

二肽基肽酶-4通过CXCR4/mTOR信号通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬的机制研究

目的探究二肽基肽酶-4(DPP-4)通过趋化因子受体4(CXCR4)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路介导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S自噬的机制。方法体外培养小鼠肺泡巨噬细胞MH-S并分组转染。分别设置PBS组(PBS培养MH-S细胞)、LPS组(100 ng/mL LPS诱导24 h)、DPP-4组(DPP-4表达病毒转染)、si-DPP-4组(si-DPP-4病毒载体转染)、DPP-4+BafA1组(DPP-4表达病毒转染+自噬抑制剂BafA1干预)及si-DPP-4+BafA1组(si-DPP-4病毒载体转染+自噬抑制剂BafA1干预)。绿色荧光蛋白(GFP)检测转染效率,稳定转染后,酶联免疫吸附试验检测MH-S细胞上清液炎症因子水平,腺病毒检测MH-S细胞自噬流变化,实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞DPP-4、CXCR4、mTOR mRNA的表达,Western blottig检测CXCR4/mTOR通路蛋白的表达。结果LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α、GFP、RPF、Merge数量,CXCR4mRNA、mTOR mRNA和CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于PBS组(P<0.05);DPP-4组与LPS组IL-1β、IL-6及TNF-α水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);DPP-4组GFP、RPF、Merge数量,DPP-4 mRNA相对表达量高于LPS组(P<0.05),CXCR4 mRNA、mTOR mRNA、CXCR4蛋白、pmTOR/mTOR蛋白相对表达量低于LPS组(P<0.05);si-DPP-4组IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于LPS组(P<0.05),GFP、RPF及MergeMerge数量低于LPS组(P<0.05);si-DPP-4组和DPP-4+BafA1组IL-1β、IL-6、TNF-α水平、CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于DPP-4组(P<0.05),GFP、RPF及Merge数量低于DPP-4组(P<0.05);si-DPP-4组DPP-4 mRNA相对表达量低于DPP-4组(P<0.05),CXCR4 mRNA、mTOR mRNA相对表达量高于DPP-4组(P<0.05);si-DPP-4+BafA1组IL-1β、IL-6水平、CXCR4 mRNA、mTOR m RNA、CXCR4蛋白、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量高于si-DPP-4组(P<0.05),GFP、RPF、Merge数量低于si-DPP-4组(P<0.05)。结论DPP-4能够调节小鼠肺巨噬细胞自噬作用,调控炎症反应,其作用机制可能与CXCR4/mTOR通路有关。

铁抑制素-1抑制丙酮醛诱导的小鼠肺泡巨噬细胞铁死亡

目的探讨丙酮醛(MG)对小鼠肺泡巨噬细胞的损伤及铁死亡抑制剂铁抑制素-1(FER-1)在其中的作用机制。方法采用小鼠肺泡巨噬细胞来源的MH-S细胞体外培养,分别用MG及FER-1进行处理,建立细胞损伤及损伤挽救模型。分别设置对照组:MH-S正常培养、MG组:90μg/mL MG、MG+FER-1组:90μg/mL MG+10μmol/mL FER-1、FER-1组:10μmol/mL FER-1。用双氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内ROS水平,脂质氧化(MDA)试剂盒检测MDA含量,细胞亚铁比色法检测亚铁离子(Fe^(2+))含量;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位变化,Western blotting检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、长链酰基辅酶A合酶4(ACSL4)的表达水平。结果90μg/mL MG处理MH-S细胞24 h,GPX4的表达水平降低(P<0.001),ACSL4的表达水平升高(P<0.01),同时出现细胞内亚铁离子浓度升高,线粒体膜电位丢失,胞内活性氧水平升高,丙二醛含量增多等现象,最终导致细胞存活率降低(P<0.01)。通过FER-1共同干预后,GPX4的表达升高、ACSL4的表达降低,胞内铁离子浓度降低、线粒体膜电位恢复、活性氧水平降低,丙二醛含量减少(P<0.001)。结论MG能够剂量依赖性诱导MH-S细胞发生铁死亡,而铁死亡抑制剂FER-1能够挽救MG所导致的铁死亡。

芒果苷抑制脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的机制研究

【目的】探究芒果苷抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症反应作用机制,为筛选治疗脓毒症的候选药物提供科学依据。【方法】选取小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)为研究对象,通过CCK-8试剂检测芒果苷对MH-S细胞的毒性作用,根据细胞毒性试验确定芒果苷的作用浓度为100μg/mL,以正常培养的MH-S细胞为对照,使用10μg/mL LPS处理24 h构建体外炎症模型(LPS组),再以100μg/mL芒果苷干预24 h(干预组);通过ELISA检测MH-S细胞上清液中的炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18)含量,采用实时荧光定量PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因表达情况,并以Western blotting和免疫荧光法检测TLR4/NF-κB信号通路的变化。【结果】芒果苷浓度低于287.60μg/mL时,对MH-S细胞无明显的毒性作用。与对照组相比,LPS组MH-S细胞中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因相对表达量极显著升高(P<0.01,下同),细胞上清液中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18含量显著(P<0.05,下同)或极显著升高;但以芒果苷干预后,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因的相对表达量及其分泌水平均显著降低,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞的炎症反应。此外,LPS组MH-S细胞中的NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平极显著高于对照组,经芒果苷干预后NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平均显著下降,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞中核转录因子的表达;LPS组MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显升高,但经芒果苷干预后MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显降低,说明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞表面TLR4的表达。【结论】芒果苷对MH-S细胞的增殖无明显抑制作用,其半数增殖抑制率(IC50)为287.60μg/mL;芒果苷对LPS诱导的MH-S细胞炎症反应具有良好的保护作用,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活而减少炎症因子的分泌有关。

小鼠肺泡巨噬细胞的提取、纯化及活性检测

目的 探讨从小鼠提取肺泡巨噬细胞 (PAM)的可行性。方法 采用支气管肺泡灌洗法从小鼠、大鼠肺内采集游离细胞 ,用贴壁法提取肺泡巨噬细胞 ,并以酸性磷酸酶 (ACP)法和吞噬鸡红细胞实验检测巨噬细胞的纯度。结果 单位肺组织 2种鼠的肺泡巨噬细胞收获量无显著性差异。结论 采用灌洗法提取小鼠肺泡巨噬细胞是一种简便易行的办法。

肺泡巨噬细胞培养上清液对小鼠红系血细胞发生的影响

采用常规实验血液学方法和造血祖细胞体外培养技术观察了肺泡巨噬细胞培养上清液对早期红系造血祖细胞和晚期红系造血祖细胞的影响.结果表明:肺泡巨噬细胞培养上清液对早期和晚期红系造血祖细胞的增殖具有双向调控作用,即低浓度上清液有促进作用,高浓度有抑制作用.结果还提示:肺泡巨噬细胞培养上清液中可能含有红细胞生成素,爆式集落刺激活性因子和前列腺素样活性物质.该物质浓度的变化调节早期和晚期红系造血祖细胞的增殖,而大肠杆菌脂多糖可促进肺泡巨噬细胞分泌这些活性物质.

结核分枝杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达的影响

探讨不同毒力结核分枝杆菌感染对小鼠肺泡巨噬细胞转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)表达的影响及其时相性变化。利用制备的卡介苗(以下简称BCG)和结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv株(以下简称H37Rv株)悬液,分别经小鼠尾静脉注射,建立各组小鼠感染模型,各组小鼠感染模型建立成功后,分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天,进行各组小鼠肺泡灌洗,收集小鼠肺泡灌洗液,获取各组小鼠肺泡巨噬细胞。应用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR和Fn的表达。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达结果显示:H37RV组与BCG组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达均高于空白对照组,在感染第7、9、11天差异最明显,具有统计学意义(P<0.05)。利用Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞TfR表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RN组、BCG组、空白对照组三组之间差异有统计学意义(P<0.05)。用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达结果显示:于模型建成后第7、9、11天,H37RV组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达量明显减低,并且于第7天时表达量最第,异有统计学意义(P<0.05)。结核分枝杆菌感染小鼠,导致小鼠肺泡巨噬细胞TfR的表达增高,而Fn的表达降低。不同毒力的结核杆菌感染后Fn蛋白表达差异并不明显,而不同毒力的结核杆菌感染后TfR蛋白的表达有差异性。

全肝缺血再灌注小鼠肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4的表达

目的探讨小鼠肝脏缺血再灌注时肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4的表达及意义。方法24只BALB/c小鼠随机分为假手术组(n=6)和肝脏缺血再灌注组(n=18)2组,并于再灌注1h、6h、12h后通过支气管肺泡灌洗获取肺泡巨噬细胞,采用荧光定量PCR及流式细胞学检测其TLR2/4mRNA和蛋白的表达。同时检测支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α的水平、肺组织湿干重比值及髓过氧化物酶活性,并进行肺组织学评分。结果与假手术组比较,肝脏缺血再灌注组各时点肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4蛋白及mRNA表达均增高(P<0.01),TLR2表达水平持续升高(P<0.01),TLR4在6h达到峰值(P<0.01)。肝脏缺血再灌注时,支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子α的水平6h最高(P<0.01),肺组织湿干重比值、髓过氧化物酶含量及肺组织学评分均从1h开始增加,并在12h达到峰值(P<0.01)。结论肝脏缺血再灌注后肺泡巨噬细胞表面Toll样受体2/4被激活,并参与了肺损伤的过程。

Wnt5a正反馈调控二氧化硅诱导的小鼠肺泡巨噬细胞铁死亡

目的探讨Wnt5a信号在二氧化硅诱导的小鼠巨噬细胞铁死亡过程中的调控作用。方法设置C57BL/6小鼠生理盐水组和二氧化硅处理组,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。免疫荧光细胞化学染色法检测小鼠BALF细胞Wnt5a、核因子κB p65(NF-κB p65)和Toll样受体4(TLR4)蛋白的表达;ELISA检测小鼠血浆和BALF上清白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。体外培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,Western blot法检测(50、100、150、200、300)μg/mL二氧化硅刺激下RAW264.7细胞磷酸化的NF-κB p65(p-NF-κB p65)、Wnt5a、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、裂解型胱天蛋白酶1(c-caspase-1)、消皮素D(gasdermin D)以及铁死亡蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)和转铁蛋白(transferrin)的表达;CellROX~?荧光探针负载法检测活性氧(ROS)的水平;实时荧光定量PCR检测Wnt5a、IL-6、IL-10以及TNF-α的mRNA表达水平;采用Wnt5a重组蛋白和小分子拮抗剂BOX5分别激活和抑制Wnt5a信号,观察Wnt5a信号在铁死亡发生过程中的调控作用。结果二氧化硅刺激激活小鼠肺泡巨噬细胞和RAW264.7小鼠巨噬细胞Wnt5a信号及相关炎性信号,释放炎性因子IL-6及TNF-α,抑制铁死亡调控因子GPX4的表达;激活Wnt5a信号协同二氧化硅作用进一步下调GPX4的表达,促进二氧化硅诱导巨噬细胞铁死亡,而Wnt5a抑制剂BOX5减缓二氧化硅的抑制GPX4作用。结论Wnt5a信号在二氧化硅诱导的小鼠巨噬细胞铁死亡发生过程中具有正反馈调控作用。

刚地弓形虫ROP16蛋白对MH-S细胞极化和凋亡的影响及其相关机制

目的 探究刚地弓形虫棒状体蛋白16 (ROP16)在小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)中的表达及其对细胞极化和凋亡的影响和相关机制。方法利用携带绿色荧光标签的ROP16过表达慢病毒转染MH-S细胞,构建稳定表达ROP16的ROP16-MH-S细胞株(过表达组),同时设空载体慢病毒转染对照组(空载体组)和无转染对照组(对照组)。转染72 h后免疫荧光法检测ROP16-MH-S中ROP16的表达及其在细胞中的定位。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的转录水平为内参照,RT-qPCR检测ROP16-MH-S细胞中促炎(M1)因子白细胞介素-1β (IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、 IL-18、 IL-6、 IL-12和抗炎(M2)因子IL-10、转化生长因子-β(TGF-β),以及抑凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)和促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase 3)、 Caspase 9等mRNA的相对转录水平;Western blotting检测ROP16-MH-S细胞中极化蛋白精氨酸酶1 (Arg-1)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、 705位点磷酸化(pTyr705)-STAT3、 STAT6、 pTyr641-STAT6和凋亡蛋白Caspase 9、 Caspase 3、 Bcl-2、 Bax蛋白的相对表达水平;流式细胞术检测ROP16-MH-S细胞的凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果转染后72 h,空载体组和过表达组90%以上的细胞可见较强的绿色荧光,过表达组细胞中可见明显红色荧光聚集在ROP16-MH-S细胞核及其周围。RT-qPCR结果显示,过表达组ROP16 mRNA的相对转录水平为8 023.459±39.325,高于空载体组(5.540±0.001)(F=83 188, P <0.01);Western blotting检测结果显示,过表达组ROP16蛋白的相对表达水平为16.349±0.746,高于空载体组(1.291±0.333)(F=831.7, P <0.01)。RT-qPCR结果显示,过表达组促炎(M1)因子IL-1β、 TNF-α、 IL-18、IL-6、 IL-12 m RNA的相对转录水平分别为0.495±0.002、 0.337±0.007、 0.378±0.014、 0.474±0.035和0.730±0.021,均低于空载体组(0.994±0.043、 1.165±0.034、 0.943±0.005、 1.153±0.028、 0.926±0.031)(F=261.7、 536.5、 1 682.0、 225.0、 78.5, P <0.01);抗炎(M2)因子IL-10、 TGF-β mRNA的相对转录水平分别为7.013±0.032和1.608±0.024,均高于空载体组(0.790±0.031、 1.091±0.027)(F=23 835.0、 200.1, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组Arg-1、 pTyr705-STAT3、 pTyr641-STAT6蛋白相对表达水平分别为2.337±0.089、 3.471±0.046、 3.905±0.045,均高于空载体组(0.871±0.014、 1.482±0.071、 1.514±0.050)(F=640.8、 1 608.0、 3 528.0, P <0.01)。流式细胞术检测结果显示,过表达组细胞凋亡率为(2.990±0.042)%,低于对照组(6.480±0.071)%和空载体组(5.655±0.290)%(F=219.7, P <0.01)。Western blotting检测结果显示,过表达组促凋亡蛋白Bax、 Caspase 3、 Caspase 9的相对表达水平分别为0.558±0.005、 0.640±0.011、0.593±0.026, Bax/Bcl-2为0.453±0.011,均低于空载体组(0.991±0.010、 0.926±0.006、 0.963±0.012、0.834±0.008)(F=2 850.0、 1 200.0、 359.3、 2 337.0, P <0.01)。RT-qPCR检测结果 显示,过表达组促凋亡基因Bax、 Caspase 3、 Caspase 9 mRNA的相对转录水平分别为0.588±0.086、 0.563±0.025和0.403±0.014, Bax/Bcl-2为0.158±0.008,均低于空载体组(0.924±0.016、 0.937±0.041、 0.807±0.032、 0.779±0.014)(F=24.7、 78.6、 154.9、 265.5, P <0.01);过表达组抑凋亡基因Bcl-2 mRNA的相对转录水平为3.702±0.362,高于空载体组(1.186±0.006)(F=104.1, P <0.01)。结论 ROP16蛋白在ROP16-MH-S细胞中(主要位于细胞核及其周围)稳定表达,可激活STAT3、 STAT6,磷酸化Tyr705-STAT3、 Tyr641-STAT6,进而调控细胞向M2极化,抑制细胞凋亡。

MTB Hsp16.3重组蛋白通过Fractalkine/CX3CR1信号轴调控小鼠肺泡巨噬细胞M2型极化

目的初步探讨Fractalkine/CX3CR1信号轴在MTB Hsp16.3重组蛋白诱导小鼠肺泡巨噬细胞向M2型极化中的作用及机制。方法提取小鼠肺泡巨噬细胞,观察细胞形态后用其特异性标志CD68鉴定;MTB Hsp16.3(100 ng/mL)刺激肺泡巨噬细胞后,采用Real-time qPCR检测TNF-α、Arg-1等极化相关分子mRNA表达水平,Western blot检测Fractalkine、CX3CR1的表达情况。用慢病毒干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,荧光显微镜观察病毒感染情况;流式细胞术检测感染效率;Real-time qPCR和Western blot检测感染前后肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达情况。采用MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞,Real-time qPCR检测各组极化相关分子mRNA表达水平;Western blot检测CD206、Arg-1的蛋白表达情况。利用Western blot检测各组中JNK、p38、ERK的磷酸化水平。结果显微镜下观察发现新分离的肺泡巨噬细胞为圆形,大小不等,约2 h后贴壁较牢,24 h后,肺泡巨噬细胞呈圆形、梭形等多种形态,且胞体更大,通过CD68鉴定为肺泡巨噬细胞;经MTB Hsp16.3处理后巨噬细胞TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1的mRNA水平明显增高(P<0.05),巨噬细胞表面Fractalkine、CX3CR1的表达增高(P<0.05),与JNK、p38的磷酸化水平升高(P<0.05)相关。干扰肺泡巨噬细胞CX3CR1的表达后,慢病毒感染效率在72 h达到最高峰,并且可降低巨噬细胞表面CX3CR1的表达。经MTB Hsp16.3刺激慢病毒感染过的肺泡巨噬细胞发现,TGF-β、IL-10、Arg-1、Fizz1 mRNA水平降低(P<0.05),CD206、Arg-1的表达水平降低(P<0.05),与JNK、p38磷酸化水平被抑制(P<0.05)相关。结论Fractalkine/CX3CR1信号轴可能参与调控MTB Hsp16.3重组蛋白诱导的肺泡巨噬细胞M2型极化,并且可能通过激活JNK、p38的磷酸化水平发挥作用。

小鼠肺泡巨噬细胞的分离及鉴定

目的分离小鼠肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM),并鉴定其纯度和吞噬活性。方法采用肺泡灌洗法分离小鼠AM,分别通过瑞氏-姬姆萨染色法和Diff-Quik染色法鉴定AM的纯度;将FITC标记的大肠埃希菌与AM按不同比例混合(10∶1、15∶1、20∶1)后孵育不同时间(20、25、30 min),荧光倒置显微镜下观察AM的吞噬活性。结果两种染色方法染色时,阳性细胞百分率均在94%以上,Diff-Quik染色法细胞阳性率略高于瑞氏-姬姆萨染色法,染色时间较瑞氏-姬姆萨染色法短,且背景干净无杂质。小鼠AM的吞噬率和吞噬指数随着FITC标记的细菌与AM比例的增加而增大,且随孵育时间的延长呈先升高再降低的趋势。当细菌与细胞比例为20∶1,孵育时间为25 min时,吞噬率和吞噬指数达最大,分别为(63.67±4.04)%和1.41±0.07。结论贴壁培养法可获得较高纯度的小鼠AM,Diff-Quik染色法鉴定巨噬细胞纯度优于瑞氏-姬姆萨染色法,其可代替瑞氏-姬姆萨染色法,成为一种快速、高效的鉴定巨噬细胞纯度的方法。

姜黄素抑制游离二氧化硅诱导小鼠肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体活化机制

目的探究姜黄素抑制游离二氧化硅(SiO2)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞(AM)内核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域蛋白3(NLRP3)炎性小体活化的分子机制。方法取自无特定病原体C57BL/6小鼠支气管肺泡灌洗液中分离的AM分为6组;其中,对照组AM不予任何刺激;SiO2刺激组AM予终质量浓度为50 mg/L的游离SiO2混悬液刺激;核转录因子-κB(NF-κB)抑制组AM予终浓度为200 nmol/L的5-(4-氟苯基)-2-脲基噻吩-3-甲酰胺预处理1 h,姜黄素低、中、高剂量组AM分别予终浓度为20、40、50μmol/L的姜黄素预处理1 h,其后均以终质量浓度为50 mg/L的游离SiO2混悬液刺激。孵育6 h后收集样品,以实时荧光定量聚合酶链式反应法检测细胞内NLRP3炎性小体相关基因NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和白细胞介素(IL)-1β的mRNA表达;以酶联免疫吸附实验检测AM中成熟IL-1β(mIL-1β)和IL-18分泌水平;以免疫印迹法检测各组细胞中Caspase-1剪切体(cleaved Caspase-1)、IL-1β前体(pro-IL-1β)、mIL-1β蛋白的表达和分泌水平。结果与对照组比较,SiO2刺激组AM中NLRP3、Caspase-1、IL-1β mRNA相对表达水平和mIL-1β、IL-18分泌水平,cleaved Caspase-1、pro-IL-1β、mIL-1β蛋白的相对表达水平与cleaved Caspase-1、mIL-1β蛋白的分泌水平均升高(P<0.05)。除cleaved Caspase-1蛋白的相对表达水平和分泌水平外,NF-κB抑制组AM中其余8个指标均低于SiO2刺激组(P<0.05)。除姜黄素低剂量组cleaved Caspase-1和mIL-1β蛋白相对表达水平外,3个姜黄素剂量组AM中上述10个指标均低于SiO2刺激组(P<0.05);且上述10个指标均随姜黄素干预剂量的增加而下降(P<0.05)。与NF-κB抑制组比较,姜黄素中剂量组AM中NLRP3、IL-1β mRNA相对表达水平和pro-IL-1β蛋白相对表达水平均升高(P<0.05),mIL-1β和IL-18分泌水平,以及cleaved Caspase-1、mIL-1β蛋白的相对表达水平与分泌水平均下降(P<0.05)。结论姜黄素可抑制SiO2诱导AM的NLRP3炎性小体活化,呈剂量-效应关系;该过程可能与姜黄素抑制NF-κB信号通路,从转录水平下调NLRP3炎性小体相关基因的表达相关;更重要的机制可能是直接阻断NLRP3炎性小体的活化、组装及下游分子剪切。

银花平感颗粒的体外抗甲型H1N1流感病毒作用

目的探讨银花平感颗粒体外抗甲型A/PR8/34(H1N1)流感病毒的作用机制。方法采用MTT比色法测定药物对巨噬细胞的最大无毒浓度(TC_0),半数细胞毒性浓度(TC_(50))及药物不同给药方式的抗病毒有效率,采用Probit回归分析计算其对病毒感染的半数抑制浓度(IC_(50))及治疗指数(TI);流感病毒H1N1感染培养的RAW264.7细胞,用利巴韦林(62.5μg/ml),银花平感颗粒高(500μg/ml)、中(250μg/ml)、低(125μg/ml)各剂量进行干预,4、16、24 h后收集细胞,实时荧光定量PCR法观察各组细胞中Toll样受体7(TLR7)、髓样分化因子88(My D88)、核因子p65(NF-κB p65)、干扰素调节因子7(IRF7)的变化。结果银花平感颗粒在31.25~500μg/ml范围内可降低流感病毒复制,其中药物治疗组在给药24 h后,抗病毒有效率最高;与正常对照组同时间比较,模型对照组TLR7、My D88、IRF7、NF-κB p65 mRNA表达水平均显著升高,且16 h达最高峰,较本组4 h、24 h差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);经药物干预后,银花平感颗粒高、中剂量组及利巴韦林组均显著下调流感病毒诱导4、16、24 h后的TLR7、My D88、IRF7和NF-κB p65 mRNA表达水平(P<0.05或P<0.01),尤以银花平感颗粒高剂量组对TLR7、My D88和NF-κB p65 mRNA表达水平的下调作用较利巴韦林组更为显著(P<0.05)。结论银花平感颗粒体外可明显抑制流感病毒复制,主要是通过治疗给药而发挥抗病毒作用,其抗病毒效果可能与其抑制TLR7/My D88/IRF7信号通路及NF-κB p65的激活有关,且高剂量对流感的治疗效果优于利巴韦林。

负载连翘苷的外泌体递药系统制备及体外评价

目的:制备负载连翘苷(phil)的外泌体(exos)递药系统(phil-exos),并考察其对人肺上皮腺癌细胞A549迁移能力的影响。方法:采用差速-超高速离心法结合超滤法获取小鼠肺泡巨噬细胞(MHS)来源的外泌体,超声法制备phil-exos并测定其粒径及电位,采用透射电子显微镜观察其形态,蛋白质免疫印迹法鉴定标志蛋白CD63和Alix,激光共聚焦显微镜观察A549细胞对phil-exos的摄取,划痕实验考察其对A549细胞迁移能力的影响。结果:phil-exos的平均粒径为(139±1)nm,聚合物分散系数(PDI)为(0.237±0.023),Zeta电位为-(19.33±0.17)mV;外观呈类球状,具有茶托状膜结构;外泌体及phil-exos对Alix高表达,CD63低表达。A549细胞8 h时对phil-exos摄取良好,且24 h时phil的迁移抑制率为46.30%,phil-exos的迁移抑制率为81.99%,phil-exos对A549细胞迁移能力具有效抑制作用。结论:phil-exos制备成功,其可显著降低A549细胞的迁移能力。

冷刺激对小鼠肺泡巨噬细胞表型的影响

目的 探讨冷刺激对小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S细胞)表型的影响。方法 将MH-S细胞置37℃培养24 h,于36、34、32℃分别冷刺激0、0.5、1、3、6、9、12 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中炎性因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及白介素-10(interleukin-10,IL-10)基因mRNA转录水平。将MH-S细胞置37℃培养24 h,于34℃冷刺激0.5 h,qRT-PCR法检测MH-S细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶(Arginase1,Arg1)基因mRNA转录水平(以冷刺激0 h为对照);免疫荧光法检测iNOS和Arg1的表达情况(以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照);Western blot法检测iNOS、TNF-α及核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的表达水平(以37℃培养0.5 h的MH-S细胞为阴性对照)。结果 34℃培养0.5 h条件下,MH-S细胞中IL-1β及IL-10基因mRNA转录水平最高,因此采用该条件建立MH-S细胞的冷刺激模型。与0 h比较,34℃培养0.5 h的MH-S细胞中iNOS、TNF-α和Arg1基因mRNA转录水平均明显升高(t分别为3.733、12.190、6.793,P均<0.05)。与阴性对照组比较,刺激组MH-S细胞中iNOS及Arg1的荧光表达强度均有所增强,其中iNOS增强更为明显。与阴性对照组比较,刺激组MH-S细胞中iNOS和TNF-α蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义(t分别为0.675和1.514,P均> 0.05);NF-κB表达水平明显升高(t=3.092,P <0.05)。结论 34℃冷刺激0.5 h可提高MH-S细胞中IL-1β、IL-10、TNF-α、iNOS、Agr1、NF-κB等炎性相关因子的表达,可激活MH-S细胞中的NF-κB信号通路,诱导炎症蛋白表达,促进细胞活化。