新生小鼠耳蜗Corti器的体外培养与观察

目的建立新生昆明小鼠耳蜗Corti器体外培养的简便方法并观察耳蜗毛细胞的组织学形态。方法取生后3～5 d昆明小鼠耳蜗基底膜,平铺在胶原凝胶表面,然后在含有1%牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中进行培养。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况。结果耳蜗基底膜经24、48 h和72 h培养后,内、外毛细胞均生长良好,其结构完整,纤毛束排列有序,无任何缺失。结论本培养方法简便有效,可用于耳蜗Corti器体外培养实验研究。

小鼠耳蜗的形态学发育过程

目的了解昆明种小鼠耳蜗听觉器官的分化发育过程。方法收集从胎龄13天直至出生后14天的昆明种小鼠的耳蜗制作成石蜡切片或者环氧树脂切片,应用苏木素伊红染色法或者甲苯胺兰染色法显示耳蜗内细胞结构,光镜下观察耳蜗细胞的分化发育演变过程。结果小鼠耳蜗发育过程经历听泡上皮增殖期(孕第13- 14天)、感觉上皮分化期(孕第15-16天)及耳蜗发育成熟期(孕第17天-出生后第14天);耳蜗结构发育成熟期占据整个发育期的2/3;耳蜗螺旋器的发育从底回开始,顶回螺旋器的发育比底回晚1-2天;毛细胞的出现早于相应上皮嵴的消失,小上皮嵴的消失亦早于大上皮嵴的退化。结论昆明种小鼠耳蜗螺旋器的分化发育有序地从底回向顶回发展,至出生前其大体结构已经基本发育成形,出生后耳蜗螺旋器的精细结构进一步分化发育直至出生后14天才渐趋完善,其中耳蜗发育成熟期在整个耳蜗发育过程中占重要地位。

重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。

新生小鼠耳蜗基底膜体外培养的实验研究

目的建立可靠的新生小鼠离体耳蜗基底膜的培养方法，为内耳的研究提供新的条件和模型。方法在显微镜下完整分离出新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜组织，采用组织贴壁法在无血清培养基中进行培养，免疫荧光法检测新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织中毛细胞及螺旋神经元的生长状态。结果新生小鼠耳蜗基底膜离体培养24 h后，显微镜下观察可见基底膜贴壁生长良好，外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出；高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构；免疫荧光法检测可见毛细胞和螺旋神经元生长良好，并能保持较长一段时间。结论组织贴壁法无血清培养新生小鼠离体耳蜗基底膜是一种理想的耳科实验造模方法。