PS-MPs和DEHP联合暴露通过NO/iNOS/NF-κB通路诱导小鼠结肠上皮细胞自噬的作用机制研究

【目的】探究聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)联合暴露通过NO/iNOS/NF-κB通路诱导小鼠结肠上皮细胞(MCEC)自噬的作用机制。【方法】依据CCK-8法测定的PS-MPs和DEHP对MCEC的半数抑制浓度(IC 50),将MCEC分为5组:对照组、PS-MPs组、DEHP组、联合组和抑制组,各组MCEC分别用培养基及含有200μg/L PS-MPs、100μmol/L DEHP、200μg/L PS-MPs+100μmol/L DEHP、200μg/L PS-MPs+100μmol/L DEHP+5 nmol/L硼替佐米(PS-341)的培养基处理24 h后,采用生化试剂盒检测NO含量及iNOS活性,通过MDC法检测自噬小体,利用免疫荧光染色、实时荧光定量PCR和Western blotting检测自噬,以及NO/iNOS/NF-κB通路相关基因的mRNA和蛋白表达水平。【结果】PS-MPs和DEHP均可抑制MCEC的活力,且IC 50分别为2315μg/L和1477μmol/L。与对照组相比,PS-MPs、DEHP、联合组细胞中NO含量、iNOS活性及NO/iNOS/NF-κB通路相关基因的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),MDC法与免疫荧光染色的荧光强度均显著增强(P<0.05),MCEC的自噬相关基因(Beclin1、ATG5、LC3-B)的mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.05);PS-341可显著缓解PS-MPs和DEHP对MCEC暴露引起的上述检测指标的变化。【结论】联合暴露于PS-MPs和DEHP可激活iNOS,使NO含量激增,上调NO/iNOS/NF-κB通路,从而诱导小鼠结肠上皮细胞自噬。

过表达miR-31对结肠炎模型小鼠TLR4/NF-κB信号通路及凋亡蛋白的调控

目的:探讨miR-31对DSS诱发结肠炎小鼠TLR4/NF-κB信号通路和凋亡相关蛋白的影响。方法:①小鼠结肠炎实验:用1%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱发小鼠溃疡性结肠炎(UC)。14只FVB非转基因小鼠随机分为control组(n=6),DSS组(n=8),16只FVB miR-31转基因小鼠随机分为miR-31过表达组(n=8),miR-31过表达+DSS组(n=8),DSS溶于水后通过饮水给予小鼠。DSS组和miR-31+DSS组第一周饮用1%DSS水,第二周饮用正常无菌水,第三周饮用1%DSS水,如此5周后造模完成,之后留取小鼠的结肠组织,通过Western blot和IHC检测小鼠结肠组织NF-κB p65、TLR4、Bax、Bcl-2蛋白的表达;TUNEL检测小鼠结肠组织细胞凋亡。②细胞培养实验:在人结肠上皮细胞系HCT 116细胞中通过脂质体转染的方法转染miR-31 mimic和inhibitor,使miR-31过表达或敲低,每组均进行三次重复,48 h后收取细胞,通过Western blot检测NF-κB p65、TLR4蛋白的表达。结果:①动物实验中,与control组相比,小鼠结肠组织中DSS组和miR-31过表达组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数均显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.05或P<0.01);且与DSS组相比,miR-31+DSS组NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平和凋亡细胞指数也显著升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01)。②细胞实验中,与control组相比,HCT 116细胞过表达miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),敲低miR-31组的NF-κB p65、TLR4蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:miR-31通过促进TLR4/NF-κB信号通路和介导肠上皮细胞凋亡促进结肠炎的发展。