牛分枝杆菌MPB51基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板 ,以MPB5 1成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增 ,获得约80 0bp的DNA片段。通过T- A克隆技术 ,将PCR产物克隆至pGEM TVector中 ,成功地构建出克隆质粒pGEM T -5 1。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM T- 5 1和pET2 8a(+) ,并将纯化的MPB5 1基因亚克隆至pET2 8a (+)中 ,构建出原核表达质粒pET2 8a- 5 1。将pET2 8a- 5 1转化至感受态E .coliBL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导和SDS PAGE分析 ,可见约30kD外源蛋白带。Westernblot分析发现 ,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性 ,从而为进一步研究MPB5 1的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础。

牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定

目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果表达、纯化了45ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。

牛分枝杆菌mpb51-63融合基因的克隆及其原核表达

为提高牛分枝杆菌(M.bovis)单一抗原的抗原性,本研究以重叠延伸拼接PCR技术将M.bovis mpb51与mpb63基因连接,并克隆至pMD18-T中,构建重组质粒pMD-51-63。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-51-63和pET28a(+),将纯化的mpb51-63融合基因亚克隆至pET28a(+)中,获得了重组表达质粒pET-51-63。该重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达约46 ku的外源融合蛋白,免疫印迹实验证实,该融合蛋白具有M.bovis的抗原反应性。为进一步研究mpb51-63融合基因及其表达产物作为牛结核病亚单位疫苗、核酸疫苗以及特异的诊断试剂奠定了基础。