牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因,连接真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠:pCE6组、pC70-83-E6组、pcDNA3.1(+)和PBS对照组,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况。结果表明,2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升,而2对照组始终维持在较低水平,且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后,pCE6组和pC70-83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著(P<0.05),2重组质粒免疫组间差异不显著(P>0.05);2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN-γ均显著高于2对照组(P<0.05),且pC70-83-E6组明显高于其他3组(P<0.05)。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。

牛分枝杆菌mpb51-mpb70融合基因的原核表达与抗原活性初步鉴定

目的通过获得牛分枝杆菌保护性抗原MPB51、MPB70的融合蛋白MPB51-MPB70,以提高单一蛋白的抗原性。方法采用重叠拼接PCR技术将牛分枝杆菌mpb51与mpb70基因融合,获得融合基因mpb51-mpb70,克隆至pMD19中,构建重组质粒pMD-51-70。酶切、纯化后连接至pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET-51-70。通过SDS-PAGE和Western blotting分析、鉴定融合蛋白的表达及抗原性。以间接ELISA比较MPB51、MPB70、MPB51-MPB70的抗原性。结果表达、纯化了45ku的融合蛋白MPB51-MPB70,并与牛结核血清发生特异性反应,且比单一蛋白反应性强。结论成功地获得了具有良好抗原性的牛分枝杆菌融合蛋白MPB51-MPB70。

牛结核杆菌MPB70-ESAT-6融合蛋白的原核表达及抗原反应性分析

为增强单个蛋白的抗原性,利用(Gly4Ser)3柔性连接肽将牛结核杆菌MPB70和ESAT-6融合。采用重叠延伸PCR技术将牛结核杆菌mpb70与esat-6基因连接,获得融合基因mpb70-esat-6,连接至T-Vector pMD19中,获得克隆质粒pMD-70-esat-6。经Bam HⅠ、EcoRⅠ酶切、纯化,并与p ET28a(+)载体连接,构建了pET-70-esat-6重组表达质粒。SDS-PAGE发现,在27.2 ku处表达了融合蛋白MPB70-ESAT-6,Western blotting证实,MPB70-ESAT-6与牛结核阳性血清反应性良好。MPB70-ESAT-6融合蛋白的研究为牛结核病诊断抗原及相关疫苗研究奠定了基础。

牛分枝杆菌特异性四联融合蛋白在牛结核病诊断中的临床应用

目的以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。方法用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。iELISA与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本;以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国黑白花奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清;对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性。结果iELISA与ICG的符合率为93.33%(140/150),与TST的总符合率为87.32%(489/560),与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。结论该方法具有较高的灵敏度与特异性,与其它方法有较高的符合率。

四种牛分枝杆菌特异性蛋白融合表达及在牛结核病诊断中的临床应用

以原核表达的MPB70-MPB83-CFP10-ESAT-6融合蛋白作为诊断抗原,建立牛结核病抗体检测间接ELISA(iELISA)。该iELISA与导致常见牛病的非相关抗原无交叉反应。用iELISA检测90份健康牛血清,确定样本阴阳性临界值(S/P)为0.17。与商品化胶体金试剂条(ICG)平行检测150份临床奶牛血清样本,结果与ICG的符合率为93.33%(140/150)。以结核菌素皮内试验(TST)为参考方法,检测了华中地区四个奶牛场的560头中国荷斯坦奶牛和90份进口奶牛结核阴性血清,结果iELISA与TST的总符合率为87.32%(489/560)。对其中22头奶牛进行鼻拭子分菌检验,4头分菌阳性奶牛的血清抗体检测也为阳性,iELISA与细菌培养的总符合率为77.27%(17/22)。以TST为参考方法,iELISA的敏感性和特异性分别为72.37%和89.67%。

牛型结核分枝杆菌分泌性蛋白MPB70.MPB83基因串联重组质粒的构建及鉴定

目的构建牛型结核分枝杆菌(MB)分泌性蛋白mpb70.mpb83基因串联重组表达质粒,为进--步利用工程菌表达、获得相应抗原蛋白奠定实验基础。方法参考NCBI上公布的MB全基因组序列(EU683972.1),在利用DNAstar7.0生物信息软件分析分泌性蛋白mpb70、mpb83抗原性基础上,选择mpb70、mpb83基因编码多肽主要抗原域,利用重叠延伸PCR技术构建pGEX-6p-mpb70+mpb83串联重组表达质粒。结果生物信息学预测MPB70、MPB83基因的抗原域分别在30-171位氨基酸和20-190位氨基酸。在mpb70、mpb83间加入16位柔性多肽序列,在线分析不影响mpb70和mpb83融合后的抗原性。pGEX-6p-1-mpb70+mpb83经双酶切获得966bp和4966bp两条片段,与预期一致;测序表明mpb70+mpb83融合基因无碱基突变和缺失,重组质粒构建正确。结论确定了MB早期标识性分泌性蛋白mpb70、mpb83基因的抗原域,获得了mpb70、mpb83串联基因,构建的重组原核表达载体柔性多肽的引人确保mpb70和mpb83的天然抗原构象且不影响融合蛋白的抗原性,为重组抗原的表达,单克隆抗体制备以及建立MB分泌性蛋白标识物的快速检测试剂盒奠定了基础。