群体感应系统核心调控子对副溶血弧菌mshH基因的调控研究

【目的】探究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子AphA和OpaR对mshH基因的转录调控。【方法】提取特定条件下副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和调控子基因突变株(ΔaphA和ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究AphA和OpaR对mshH基因的转录调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;将mshH启动子区DNA序列克隆入pHRP309质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,并将其转入WT、ΔaphA和ΔopaR中,获得LacZ实验菌株,再通过LacZ报告基因融合实验研究AphA和OpaR对mshH基因的调控关系以及mshH基因的时相依赖性表达特性;PCR扩增mshH上游启动子区DNA序列,并纯化His-AphA和His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和DNase I足迹实验,研究体外条件下His-AphA和His-OpaR对靶基因启动子区DNA片段是否具有直接的结合作用以及具体的结合位点。【结果】mshH基因的表达水平随着培养时间的延长而升高;低细菌密度时,AphA抑制mshH基因的转录,但His-AphA对mshH启动子区DNA序列没有结合活性;高细菌密度时,OpaR对mshH基因的转录具有激活作用,His-OpaR对位于mshH基因的翻译起始位点上游–160至–80 bp和–58至–19 bp之间的DNA序列具有结合活性。【结论】低细菌密度时,AphA可能是通过间接方式抑制mshH基因的转录;高细菌密度时,OpaR直接结合到mshH调控区DNA片段上,并激活其转录。