湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析

本研究旨在阐明边缘无浆体(A.marginale)MSP4基因的遗传变异情况。应用PCR扩增A.marginale虫株的MSP4基因的部分序列(pMSP4),将其克隆至pGEM-T载体,重组质粒经菌落PCR鉴定及序列分析,结果表明来自湖南省的6株边缘pMSP4的序列长度均为530bp,与GenBank中登录的A.marginale相应序列相似性在98.3%以上,与其它无浆体的差异大于9.7%。由于A.marginale pMSP4序列种内相对保守,种间差异较大,因此,可作为种间遗传变异研究的标记。本研究为A.marginale的分子流行病学调查等提供了实验依据。

新疆南部地区绵羊无形体流行情况调查

试验旨在确定新疆南部地区绵羊中绵羊无形体基因型种类,共采集240份绵羊血液样本,其中成羊和羔羊各120份样本。样本进行DNA提取,并应用绵羊无形体msp4基因种特异性引物对总DNA进行PCR扩增。测序结果应用DNAstar软件进行核苷酸序列和氨基酸序列比对,并应用MEGA 7.0构建系统进化树。结果显示,绵羊无形体在绵羊中总检出率为22.5%(54/240),其中成年雌性绵羊和羔羊无形体的检出率分别为37.5%(45/120)和7.5%(9/120)。所得序列经比对发现,其同源性为99.7%~100.0%,存在多个核苷酸位点发生改变,并获得3种基因型,分别为基因型Ⅱ型、Ⅲ型、GB3型,各基因型在绵羊中总流行率为5.4%(13/240)、15.0%(36/240)、2.1%(5/240)。研究表明,我国新疆南部地区绵羊中存在3种绵羊无形体基因型,其中基因Ⅲ型是新疆南部地区绵羊中普遍存在的基因型。

海南部分地区黄牛无浆体分子流行病学调查及遗传多样性分析

无浆体病(Anaplasmosis)是由几种无浆体(Anaplasma)经蜱媒传播的一种立克次氏体病。通过巢式PCR和常规PCR方法对海南地区4市县黄牛(N=176)进行无浆体分子流行病学调查。结果显示,黄牛无浆体感染率为14.8%,其中A.bovis、A.pagocytophilum和A.marginale感染率分别为11.4%、6.3%和5.7%,A.bovis在海南地区黄牛感染率最高,系统发育树分析显示A.bovis、A.marginale和A.pagocytophilum均无地理隔离分化特征,但A.pagocytophilum存在宿主特异性,通过A.pagocytophilum 16S rRNA/MSP4基因研究,可以进行溯源分析,了解海南地区无浆体病原是否存在宿主分化及地理分化特征,从而为该病防治提供有利支持。

中国西南横断山区小型兽类嗜吞噬细胞无形体基因的检测及序列测定

目的了解中国西南横断山区小型兽类自然感染嗜吞噬细胞无形体的情况。方法采集位于滇西北横断山区的高黎贡山山脉、香格里拉雪山等山地（海拔1000～4500m）林区的小型兽类脏器标本以低温保存和运输，所获标本在实验室应用聚合酶链反应（PCR）方法对嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因和Msp4基因片段进行扩增测序，并将所测序列与GenBank中注册的基因序列进行相似性比较。结果共检测小型兽类5目18属35种共436只，从6属11种小型兽类中发现阳性标本32份，总阳性率为7．34％。其中，高黎贡山林区检测小型兽类标本25种301只，阳性26份，阳性率为8．64％（26／301）；香格里拉雪山等林区检测小型兽类标本19种135只，阳性6份，阳性率为4．44％（6／135）；阳性标本绝大部分发现于小型兽类中的啮齿类动物。序列比较分析表明：不同小型兽类间的16SrRNA基因序列相似性为99％-100％，且与吉林野鼠中检测的无形体相对应片段（GenBank：DQ449948）最相近，相似性达99％-100％。对其Msp4基因核苷酸序列进一步分析发现与GenBank中相应片段相似性为95％-97％，提示中国西南横断山区小型兽类所感染无形体株变异较大。结论首次证实和发现中国西南横断山区6属11种小型兽类自然感染嗜吞噬细胞无形体，其中啮齿类动物可能是这一地区嗜吞噬细胞无形体的主要宿主。

边缘无浆体SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中边缘无浆体的MSP4基因序列(EU677383)设计2对引物(AmspF3/R3和Am-spF4/R4)并克隆MSP4部分基因,构建含有MSP4基因的标准质粒,以AmspF3/R3为引物进行荧光定量PCR,建立了边缘无浆体的MSP4SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用于临床血样检测。结果显示,该方法可以检测到1×102 copies/μL的标准质粒DNA,该方法对绵羊无浆体、附红细胞体、东方巴贝斯虫、组织滴虫提取的DNA均为阴性反应。结果表明,该方法与常规PCR方法比较,阳性及阴性符合率都为100%,且具有敏感、重复性好、无污染特性,并具有能准确定量的特点,说明该方法具有很好的应用前景和研究价值。