猪孤雌激活早期胚胎线粒体分布及mtDNA拷贝数变化的研究

本研究通过线粒体分子探针标记技术检测孤雌激活早期胚胎线粒体的分布变化,运用实时荧光定量PCR技术检测mtDNA拷贝数的变化,揭示早期胚胎发育过程中线粒体分布、mtDNA拷贝数变化趋势。结果表明,成熟卵母细胞电激活后,由2-细胞胚胎开始,卵裂球内线粒体分布均匀且密集,每个细胞均有分布,卵裂球之外的空隙未见线粒体分布,直到囊胚形成,线粒体均有分布。孤雌激活4-细胞胚胎mtDNA拷贝数显著高于8-细胞胚胎mtDNA拷贝数(907210.77±145520.77,186224.33±103308.00,P<0.05),但显著低于2-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚的mtDNA拷贝数(1563422.54±224666.51、1697626.25±176999.53和1752301.29±101146.64,P<0.05)。孤雌激活扩张囊胚mtDNA拷贝数最高,为2812545.67±156819.31,显著高于其他发育时期胚胎的mtDNA拷贝数(P<0.05)。由此可见,孤雌激活早期胚胎发育进程中线粒体分布及mtDNA拷贝数会发生变化。

卵母细胞及胚胎mtDNA拷贝数在辅助生殖技术研究中的重要价值

过去的30年中,辅助生殖技术(ART)领域有了巨大进步,但仍有许多难题尚待解决,如:IVF临床妊娠率仍不高,高龄妇女生育难题,不明原因胚胎发育停滞等。上述问题可能均与卵母细胞质量低下相关。而线粒体是人类卵母细胞和胚胎发育潜能的关键调控因素,卵母细胞线粒体DNA(mtD-NA)拷贝数在卵母细胞和胚胎发育过程中起重要作用。mtDNA拷贝数可能是卵母细胞发育潜能的标志物。本文就mtDNA拷贝数在卵母细胞和胚胎中的研究进展进行综述,并对其临床应用提出了展望。

卵丘颗粒细胞mtDNA拷贝数及4977bp缺失在卵巢储备功能减退中的研究

目的分析卵巢储备功能减退(DOR)患者卵丘颗粒细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数和4977 bp缺失情况,初步探讨DOR患者卵丘颗粒细胞mtDNA结构是否完整。方法选取2019年4月至2020年10于河北省生殖医院行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者33例,根据卵巢储备功能情况分为DOR组(17例),卵巢储备功能正常(NOR)组(16例),比较两组患者的一般情况、实验室指标及妊娠结局。于取卵日挑选患者卵泡液中的卵冠丘复合体后,分别收集每位患者卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞团,用线粒体分离试剂盒提取卵丘颗粒细胞的线粒体后提取mtDNA,采用实时定量PCR检测卵丘颗粒细胞mtDNA的拷贝数和4977 bp缺失情况,比较两组患者mtDNA 4977 bp缺失率及拷贝数的差异。结果两组患者的体质量指数(BMI)、基础性激素水平无统计学差异(P>0.05);DOR组的女方年龄显著高于NOR组(P<0.05),DOR组基础窦卵泡数(AFC)显著低于NOR组(P<0.05)。两组患者卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率、临床妊娠率、种植率均无统计学差异(P>0.05);DOR组促性腺激素(Gn)天数、Gn用量、平均获卵数和受精率显著低于NOR组(P<0.05)。DOR组mtDNA拷贝数(1.04±0.48)略低于NOR组的mtDNA拷贝数(1.13±0.52),但两者尚无显著性差异(P>0.05);且DOR组和NOR组的卵丘颗粒细胞mtDNA均未检测到4977 bp缺失。结论DOR患者卵丘颗粒细胞mtDNA拷贝数并未明显减少,也未见4977 bp片段缺失;其可能与DOR患者临床结局较差并无直接关联。

大熊猫粪便中mtDNA拷贝数与月龄的关系

动物在生长发育不同阶段组织器官的代谢水平有所差异,线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数在一定程度上反映了机体的生理状态和代谢强度。以64只大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)粪便DNA为材料,采用实时荧光定量PCR方法,验证了肠道上皮组织中平均每个细胞mtDNA的拷贝数(N_(mpc))与月龄之间具有显著相关性(R^(2)=0.129,P=0.004),且呈现出随着月龄的增长而下降的趋势。幼龄个体的N_(mpc)远高于中、老龄个体,且个体差异很大。此外,性别对N_(mpc)也具有明显的影响,同一生长阶段的雄性比雌性更高。这些发现为进一步探究肠道上皮细胞mtDNA拷贝数与生长发育和衰老之间的关系,以及利用其作为指标来评估机体的生理状况提供了依据。

人类多种疾病中mtDNA拷贝数的变化

线粒体是细胞能量和自由基代谢中心,在细胞生命活动中发挥着重要作用,而mt DNA拷贝数是决定线粒体功能的重要因素。由于mt DNA缺乏组蛋白的保护和损伤修复系统,又暴露在氧化磷酸化产生的高氧环境中,易受损引起拷贝数变化,从而影响线粒体的功能。大量研究表明,多种疾病的发生发展与mt DNA拷贝数变化密切相关。该文综述了癌症、神经退行性疾病、心脑血管疾病、精神疾病等各种疾病中mt DNA拷贝数的变化情况,以期从中发现疾病相关mt DNA拷贝数的变化规律和调控机制。

外周血线粒体DNA D环区甲基化及拷贝数与帕金森病相关性研究

背景 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年的神经退行性疾病,线粒体DNA(mtDNA)甲基化可能参与PD的发生和发展,目前相关研究极少。目的 观察PD患者外周血mtDNA D环区的甲基化水平及其拷贝数的变化,分析D环区甲基化与mtDNA拷贝数的相关性,探讨PD的发病机制。方法 选取2020-2022年内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院PD患者(PD组)和健康体检者(对照组)各30例[(66.63±7.95)岁vs (63.50±4.96)岁],每组男性、女性各15例,采用质谱法(MassARRAY)检测外周血mtDNA D环区的甲基化水平,采用实时定量PCR法(qRT-PCR)检测mt DNA拷贝数。结果 PD组与对照组的外周血mtDNA中D环区总体甲基化率及各CpG位点甲基化率差异无统计学意义(P>0.05),早期PD患者与中晚期PD患者的外周血mtDNA中D环区总体甲基化率及各CpG位点甲基化率差异无统计学意义(P>0.05)。PD患者外周血mtDNA拷贝数低于对照组(P=0.02),中晚期PD患者外周血mtDNA拷贝数低于早期PD患者,差异有统计学意义(P=0.012)。mtDNA D环区第1、15个CpG位点(即人mtDNA序列第112、413位的核苷酸)甲基化率与mtDNA拷贝数呈负相关(r=-0.257,P=0.047;r=-0.517,P<0.001)。Logistic回归分析显示,mtDNA拷贝数越高,PD发生概率越低(OR=0.119,P=0.023)。结论 PD患者外周血mtDNA D环区甲基化水平未发生显著改变,但其外周血mt DNA拷贝数降低,且随着PD病程的进展呈动态变化,mtDNA拷贝数有望成为预测PD发生及病程进展的指标。D环区的甲基化可能会负向调控mtDNA的复制与转录。

高血压大鼠线粒体DNA拷贝数与端粒长度的相关性研究

目的探讨高血压大鼠外周血液白细胞线粒体DNA拷贝数和端粒长度的变化,以及二者之间的相关性。方法 SD大鼠40只,随机分为3组:高血压组(15只)、假手术组(15只)和空白对照组(10只)。高血压组采用双侧肾动脉后支结扎,术后予以8%NaCl饲料的方法构建高血压大鼠模型。选取术后4个月为观察终点,利用鼠尾血压计测量血压,随后行眶下静脉丛取血,提取血液基因组DNA,Real-time PCR法测量相对线粒体DNA拷贝数和端粒长度。结果术后4个月时与假手术组比较,高血压组大鼠血压显著升高[(178.36±10.21)比(128.47±8.74)mm Hg,P<0.01],线粒体DNA拷贝数显著增加[(1.49±0.43)比(1.09±0.51),P<0.05],端粒长度显著缩短[(0.83±0.23)比(1.04±0.29),P<0.05]。高血压组大鼠线粒体DNA拷贝数与端粒长度变化呈负相关(r=-0.589,P<0.05)。结论高血压大鼠模型可出现外周血白细胞线粒体DNA拷贝数升高和端粒长度缩短,且二者呈负相关。

卵母细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数在卵巢储备功能下降中的研究

目的:初步探讨卵母细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数对卵巢储备功能下降患者生育潜能的影响。方法:选取IVF-ET治疗的不孕症患者80例,按照卵巢储备功能状态分为卵巢储备功能下降(DOR)组和卵巢储备功能正常(NOR)组,胚胎移植日收集患者自愿捐赠的未受精的废弃MII期卵母细胞,Real-timePCR方法定量检测比较卵母细胞mtDNA拷贝数。结果:共收集到废弃的MII期卵母细胞110个,其中DOR组46个,NOR组64个。DOR组卵母细胞mtDNA拷贝数下降(9.96×104±5.21×104vs1.77×105±7.27×104),组间具有显著性差异(P<0.05)。结论:卵巢储备功能下降患者卵母细胞mtDNA拷贝数减少,可能与其卵母细胞发育潜能下降相关。

线粒体移植对水牛卵母细胞发育潜能的影响

本研究以水牛卵泡颗粒细胞作为线粒体的来源细胞,初步探讨水牛卵母细胞进行线粒体移植(MIT)后对其发育潜能的影响。试验比较了不同级别水牛卵母细胞mtDNA的拷贝数,并研究了水牛卵母细胞进行MIT后,其后续早期胚胎发育及胚胎线粒体膜电位(ΔΨm)的变化情况。结果显示:一级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于二、三级卵母细胞组((202 101±74 432)vs(118 483±17 028),(39 177±7 938),P<0.01),二级卵母细胞组的平均mtDNA拷贝数极显著高于三级卵母细胞组((118 483±17 028)vs(39 177±7 938),P<0.01);孤雌激活处理后发现:一级卵母细胞组的卵裂率和囊胚率也都极显著高于二、三级卵母细胞组(P<0.01),而二级卵母细胞组激活后胚胎的卵裂率和囊胚率亦极显著高于三级卵母细胞组(P<0.01)。用Mito-Tracker探针标记的外源线粒体经移植后,会随着胚胎的发育而发生移动,分布到各个卵裂球中;且发现二级卵母细胞MIT组孤雌激活后的囊胚率显著高于对照组和空注组(27.3%vs 17.4%,7.84%,P<0.05),而三级卵母细胞MIT组激活后的囊胚率与对照组和空注组差异不显著(P>0.05);对胚胎ΔΨm检测发现,水牛植入前各时期胚胎ΔΨm总体呈上升趋势,线粒体移植后胚胎各时期的ΔΨm均显著高于对照组(P<0.05)。综上表明:不同质量的水牛卵母细胞其mtDNA拷贝数存在显著差异,且mtDNA拷贝数与卵母细胞质量和发育能力成正相关;通过移植外源线粒体可以提高二级水牛卵母细胞的发育潜能。

孕期PAHs暴露与胎盘线粒体拷贝数的关联研究

目的分析孕妇多环芳烃(PAHs)暴露水平与胎盘线粒体DNA (mtDNA)拷贝数的相关性,为孕期PAHs暴露对子代健康潜在影响研究提供依据。方法选择2019年1—10月在乌鲁木齐市某三甲医院分娩的200名孕妇及其新生儿为研究对象,根据分娩时间分为采暖期组(1—4月)和非采暖期组(7—10月),收集年龄、民族、文化程度和家庭采暖方式等资料;采用气相色谱-质谱联用法测定孕妇及其新生儿血液16种PAHs总浓度;提取胎盘DNA,采用实时荧光定量PCR法检测胎盘mtDNA拷贝数;采用Spearman秩相关分析血PAHs总浓度与胎盘mtDNA拷贝数的相关性。结果纳入采暖期组和非采暖期组各100人,年龄分别为29 (3)岁和29 (4)岁,孕期分别为(275.06±0.72)和(276.82±0.66) d。采暖期组孕妇血PAHs总浓度[15.71 (4.30) vs. 12.98 (5.49)μg/L]、新生儿血PAHs总浓度[14.29 (4.25)vs. 11.24 (5.09)μg/L]和胎盘mtDNA拷贝数[4.67 (1.18) vs. 4.51 (0.62)]均高于非采暖期组(P<0.05)。孕妇和新生儿血PAHs总浓度均与胎盘mtDNA拷贝数呈正相关(rs=0.240,P=0.001;rs=0.273,P<0.001)。采暖期组孕妇血PAHs总浓度与胎盘mtDNA拷贝数呈正相关(rs=0.245,P=0.014);非采暖期组新生儿血PAHs浓度与胎盘mtDNA拷贝数呈正相关(rs=0.292,P=0.003)。结论孕妇PAHs暴露水平与胎盘mtDNA拷贝数呈正相关,孕妇PAHs暴露与新生儿氧化应激存在一定相关性。

线粒体DNA单体型M8a对转线粒体细胞线粒体能量代谢的影响

为了观察线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)单体型M8a对细胞线粒体能量代谢的影响,该研究利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导血小板–细胞融合技术,构建mt DNA单体型M8a和G2a转线粒体细胞(transmitochondrial cytoplasmic hybrid cell,cybrid)模型。后续运用Real-time PCR检测细胞mt DNA拷贝数和RNA转录水平,多功能酶标仪检测细胞活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),线粒体呼吸测定仪检测细胞内源性氧呼吸(oxygen consumption,OC)情况。结果表明,与G2a细胞相比,M8a细胞mt DNA拷贝数和线粒体轻链(L链)转录水平明显降低(P<0.01),细胞基础耗氧量、ATP合成耗氧量、最大氧呼吸能力和MMP显著下降(P<0.05),细胞ROS水平显著上升(P<0.05)。mt DNA单体型M8a细胞的线粒体呼吸功能受损,可能增加了该单体型人群罹患2型糖尿病的风险。

环境污染物的毒性作用与线粒体DNA的变化

线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所,是为细胞供能的细胞器,具有一套独立于核DNA的遗传物质,即线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA). mtDNA编码了37个基因,包括13个呼吸链相关的多肽、22种t RNA以及2种rRNA基因.线粒体异常可直接导致细胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成减少、细胞能量不足. mtDNA拷贝数及表观遗传的调控对于线粒体行使基本功能至关重要.环境污染物进入生物体内后诱导产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS),造成生物体氧化应激反应,从而引发代谢异常,进而诱发各种疾病.因为靠近氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)发生的场所,并且缺乏组蛋白的保护和足够的DNA损伤修复能力,与核DNA相比, mtDNA更容易受到氧化应激反应的影响.而多种环境污染物暴露可引发过多的活性氧活动,进而可导致mtDNA拷贝数及mtDNA表观遗传修饰的改变. mtDNA异常也正在作为一种可能的环境污染物暴露后的生物标志物,受到越来越多的研究关注.本文简要介绍了mtDNA拷贝数、mtDNA可能的表观遗传修饰以及相关调控机制,并总结了各种类型环境污染物暴露引起mtDNA拷贝数和甲基化变化的研究结果,同时对如何深入研究环境污染物影响mtDNA及分子机制进行了展望.