多重PCR—一种高效快速的分子生物学技术

多重PCR是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段的PCR技术,具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。简述了多重PCR的基本原理,综述了多重PCR在医学、遗传学、植物生物学、海洋生物学等生命科学领域的应用现状,对目的片段选择、引物设计、复性温度和时间等PCR技术要素进行了分析,并介绍了其最新进展。

多重PCR法区分枣园两种菱纹叶蝉及检测其体内枣疯病植原体

【目的】目前发现,北京枣园中的凹缘菱纹叶蝉Hishimonus sellatus(Uhler)和片突菱纹叶蝉Hishimonus lamellatus Cai混同发生。已知凹缘菱纹叶蝉可以传播枣疯病,而片突菱纹叶蝉是否携带枣疯病植原体尚待证明。正确鉴别区分枣园中菱纹叶蝉的种类并测定其体内感染枣疯病植原体情况有助于阐明田间枣疯病的流行规律,从而提出有效的预防枣疯病及其媒介昆虫措施显得十分重要。传统形态学鉴定两种菱纹叶蝉种类的方法局限于雄性成虫外生殖器,本研究目的在于建立一种快速的分子生物学方法,在区分枣园中两种枣菱纹叶蝉的同时,可检测虫体内的枣疯病植原体。【方法】以凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉的COI基因以及枣疯病植原体的16S r DNA为扩增目标,分别设计引物,建立一种包含3对引物的多重PCR体系。测试该多重PCR体系对叶蝉总DNA的灵敏度、准确性,以及当两种叶蝉DNA同时存在时的辨别能力和对枣疯病植原体16S r DNA的灵敏度。【结果】该多重PCR可以准确区分凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉,并对虫体内枣疯病植原体实现检测,其对昆虫总DNA的灵敏度达到0.012 ng,对枣疯病植原体16S r DNA模板的灵敏度达到900拷贝。【结论】该方法极大方便了对枣菱纹叶蝉的田间种群发生动态及虫体中枣疯病植原体感染的监测。

多重PCR检测冷却肉中的3种致病菌

分别针对沙门氏菌(Salmonella choleraesuissubs.choleraesuis,S)编码DNA结合蛋白的基因hns、大肠O157:H7(Escherichia coliO157:H7,E)编码外膜蛋白紧密素的基因eaeA和单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L)溶血素O基因Hly设计3对引物,建立同步检测肉制品中3中致病菌的多重PCR方法。通过对多重PCR特异性和灵敏度进行分析,对多重PCR反应条件进行优化,结果表明,此方法简便、快速,可使混菌检测灵敏度达到103cfu/mL。

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用

在已经建立的胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了APP、HPS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的442 bp,和HPS的1 090 bp的特异性片段,并应用于临床检测。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。

多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbEf、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及初步应用

根据胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)apxIVA毒素基因序列和16SrRNA序列分别设计了一对特异性引物P1P4和一对通用引物S7S10,建立了检测App全部15个血清型的复合PCR方法。对App的15个血清型国际参考株和国内的11个App菌株进行检测,都能得到363bp和692bp的两个扩增片段。而放线杆菌等13株参考菌株只能得到692bp的扩增片段。该方法能将15个血清型的App菌株鉴定到种。检测的灵敏度达9pgDNA1300CFU。用建立的方法检测临床分离的302株可疑菌株,阳性4株,与其它鉴定方法相符。结果表明复合PCR可用于App菌株的鉴定。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

4种感染性腹泻病原菌免疫磁珠-多重PCR快速检测体系的建立

目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。

复合PCR技术在ABO血型基因分型中的应用

目的探讨复合PCR技术在ABO血型基因分型方法中的应用。方法通过实验研究摸索复合PCR的条件和规律,采用单管同时扩增出ABO基因的第6、7外显子后,使用限制性内切酶对复合PCR产物进行酶切消化。结果通过最佳实验反应条件的获得,可建立ABO血型基因分型方法。结论复合PCR技术在建立ABO血型基因分型方法的应用中,具有其特殊性。

四种转基因玉米多重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测4种转化体的多重PCR方法,选择进口转基因玉米最为常见的4种转化体Bt11、Bt176、MON810和MON863,利用国家标准中现行有效的转化体检测引物作为多重PCR检测体系引物,对多重PCR退火温度和引物浓度等进行优化。结果表明,多重PCR方法的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4,通过建立快速、准确、高效的多重PCR为进口转基因玉米检测提供有价值的参考。

多重PCR技术在橡胶树转基因分子鉴定中的应用

为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列,并排除扩增结果的假阴性,利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因(HbActin)、目标基因新霉素磷酸转移酶II(NptII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的多重PCR检测体系。利用2种酶(PCR Mix酶和Taq酶)对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明:多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致,且多重PCR体系带型清晰,无非特异性扩增,更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。

麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR法的建立

目的建立针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR检测方法。方法分别根据麻疹病毒M基因、风疹病毒E基因和腮腺炎病毒M基因设计3对引物,建立同时检测3种病毒的多重RT-PCR,并评估其灵敏度和特异性。结果建立的多重RT-PCR可同时或分别扩增的3种病毒的111 bp、352 bp和274 bp基因片段,其灵敏度分别达到2.1、2.1、2.2lgCCID 50/mL;而与脊髓灰质炎病毒和乙型脑炎病毒无交叉反应。结论建立的多重RT-PCR可用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的快速检测。

多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

为建立禽分枝杆菌多重PCR鉴定方法,根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物,选用我国禽结核参考菌株(CVCC 68201)基因组DNA为模板,优化了退火温度,测定了DNA最小检测量,并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系,对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明,禽结核参考菌株(CVCC 68201)能很好的扩增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dna J基因片段)三条目的条带,基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL,目的条带在退火温度50℃~62℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测,并设立牛分枝杆菌作为阴性对照,最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类:禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种,与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此,基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。

多重PCR检测食品中转基因成分研究

〔目的〕建立检测转基因食品的多重PCR—聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测体系。〔方法〕针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件,包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因,同时选定植物本身固有的大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因,设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR,结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系,对转基因食品进行检测,1￣2天能完成整个检测过程。对珠海地区市售的大豆、玉米、油菜及其加工产品共185个样品中的转基因成分进行了初步调查。〔结果〕建立的多重PCR检测体系稳定可靠、特异性好,灵敏度高。调查的185份可疑食品样品中,转基因阳性率达27.6%。〔结论〕该检测体系快速可靠、灵敏准确、特异性好,且操作简便、成本低廉,是一种进行转基因食品检测的良好的技术模式。对珠海地区的转基因食品状况有了一定了解。

二重正交设计用于多重PCR条件优化

以猪圆环病毒Ⅰ,Ⅱ(PCVⅠ,PCVⅡ)为材料,探索多重PCR(multiplex PCR)最佳反应体系.结果表明,两次正交实验共34次反应,就获得了PCVⅠ,PCVⅡ多重PCR扩增的最佳条件组合,所得优化条件稳定,重复性好,说明正交法是一种快速,高效,经济的多重PCR条件优化手段。

荧光标记复合PCR扩增微卫星位点的构建与优化

采用毛细管电泳技术,构建并优化了荧光标记复合PCR同时扩增多个微卫星位点。根据设计所扩增微卫星位点的期望长度,将9个微卫星位点分成两组,5个位点用FAM(蓝色)标记,4个位点用HEX(绿色)标记;两种荧光类型分组优化,用琼脂糖胶电泳检测。荧光标记的复合PCR扩增8个中华绒螯蟹样品的9个微卫星位点,采用ABI3730xl毛细管电泳检测,以ROX500(红色)为长度标准物,结果经Genemapper3.5软件分析,检测结果表明毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物不仅精确读取微卫星位点的长度(分辨率高达1bp),还能区分微卫星位点复制时滑链所引起的"回声斑";调整各微卫星位点引物比例使所有位点扩增强弱均匀。逐一检测复合PCR基本参数(dNTP浓度、PCR程序和模板DNA用量)对复合PCR产物的影响,优化PCR。结果表明通过毛细管电泳检测荧光标记复合PCR产物来读取微卫星位点的基因型具有精确性、高效性和稳定性。

猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A型轮状病毒多重RT-PCR方法的建立及其应用

为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(RVA)的敏感、特异的多重RT-PCR(mRT-PCR)方法,本试验分别针对PEDV和TGEV的N基因、RVA的VP7基因设计了4对引物(其中针对PEDV N基因的引物为内、外2对),结合mRT-PCR和PEDV的套式RT-PCR(nRTPCR),建立了检测PEDV、TGEV和RVA的mRT-PCR方法。mRT-PCR能够同时扩增出针对3种病毒的预期大小的目的核苷酸片段,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒及猪圆环病毒2型等病毒无交叉反应;可以检测到PEDV、TGEV和RVA的最低核酸浓度分别为16.07、803.9和321.5μg/L。应用mRT-PCR检测了31份腹泻仔猪的血清、肛拭子或小肠组织,其中PEDV、TGEV与RVA的阳性率分别为61.29%、6.45%和25.81%,并检测到了PEDV与RVA或TGEV双重感染及PEDV、TGEV和RVA三重感染的样品。在检测临床样品时,mRT-PCR和单项RT-PCR检出PEDV、TGEV和RVA的符合率分别为96.77%、93.54%和93.54%。上述结果表明,mRTPCR能够快速鉴别检测PEDV、TGEV和RVA 3种病毒,PEDV是引起当前仔猪腹泻的主要病原。

食品中阪崎肠杆菌多重PCR检测方法的建立

目的建立并优化食品中阪崎肠杆菌检测的多重PCR方法。方法以阪崎肠杆菌ITS序列,16s rDNA和ompA基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化多重PCR反应体系;验证其特异性、灵敏度和抗干扰能力;并在实际样品中进行阪崎肠杆菌的检测,检测结果与现行国家标准方法进行比较。结果该多重PCR反应体系具有良好的特异性、灵敏度和较强的抗干扰能力。人工污染奶粉样品的模拟实验表明,增菌后该多重PCR反应体系可以检出1 CFU/100 g奶粉的阪崎肠杆菌。108份不同种类的实际样品中共检出阪崎肠杆菌10份,检出率为9.26%,检测结果与采用现行国家标准方法测定具有良好的一致性。结论本研究所建立的多重PCR方法特异好、灵敏较高、结果准确,可用于食品中阪崎肠杆菌的日常检测。

犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒三重PCR检测方法的建立

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CCV）的基因序列保守片段分别设计特异性引物,建立了可以同时检测CDV（684 bp）、CPV（213 bp）和CCV（417 bp）的三重PCR方法。特异性结果表明,所建立的体系只能扩增CDV、CPV、CCV,而不能扩增犬腺病毒Ⅱ型（CAV-Ⅱ）和犬副流感病毒（CPIV）;敏感性试验表明,该方法对CDV、CPV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10^- 2、6.0×10^-2和6.7×10^-2 copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。采用建立的三重PCR方法对北京、山东地区收集的临床粪便样品进行检测结果表明,使用三重PCR体系的扩增结果与单项PCR扩增结果一致,符合率为100%。以上结果表明该方法快速、敏感、特异性强,对上述3种病毒能够进行快速鉴定诊断,为临床诊断提供了快速简便的方法。